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        重組山羊FSH基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)

        2011-07-12 05:11:24楊歡利毛英姿丁家桐
        黑龍江動物繁殖 2011年5期
        關(guān)鍵詞:畢赤信號肽卵泡

        楊歡利,毛英姿,丁家桐

        (1.浙江省臺州醫(yī)院 生殖中心,浙江 臺州 317000;2.揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚州 225009)

        促卵泡素(FSH)是一種糖蛋白激素,對配子的發(fā)生、分化、成熟及與生殖有關(guān)行為的發(fā)生都起著重要的作用。在動物生殖過程中FSH與LH協(xié)同作用可促使雄性動物生精上皮發(fā)育和精子成熟,并可促使雌性動物卵泡成熟、抑制卵泡閉鎖、誘導(dǎo)芳香酶活性、刺激顆粒細(xì)胞增生及誘導(dǎo)促黃體素(LH)和催乳素(PRL)受體產(chǎn)生[1]。

        目前,動物生產(chǎn)中用的FSH主要從各種家畜腦垂體組織純化而來的,垂體提取的FSH純度低,生物活性不穩(wěn)定,而且常不同程度地混雜有LH及其它潛在傳染性病原[2],其負(fù)作用較大,影響了FSH的廣泛應(yīng)用。利用基因工程可獲得純度較高的且不含LH的重組促卵泡素,而且生物活性穩(wěn)定[3,4]。重組FSH的應(yīng)用,可以改善超數(shù)排卵的效果,增加結(jié)果的可預(yù)見性,并且能夠優(yōu)化超排的程序。

        巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是被廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng),具有較強的乙醇氧化酶啟動子,可有效地控制外源蛋白的表達(dá),其翻譯后的糖基化修飾、折疊、加工和分泌的環(huán)境使生產(chǎn)的蛋白具有天然的高級結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性,同時具有遺傳穩(wěn)定性強,可以發(fā)酵培養(yǎng)到較高的細(xì)胞濃度等優(yōu)點[5]。

        本研究利用基因重組技術(shù)構(gòu)建FSH的酵母表達(dá)載體并電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中,通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá),來檢測畢赤酵母表達(dá)載體在FSH表達(dá)中的應(yīng)用,為重組FSH激素的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 質(zhì)粒、菌株

        質(zhì)粒pcDNAFSHα,β、大腸桿菌DH5α由本實驗室構(gòu)建和保存;畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA、畢赤酵母菌株GS115購自Invitrogen公司。

        1.1.2 主要試劑

        限制酶EcoRI、Not I、Sac I, XhoI、XbaI,高保真聚合酶Pyrobest TM DNA Polymerase,DNA Ligation Kit Ver 2.0, MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0,DL2 000, DL15 000,Agarose Gel DNA Puri fication Kit Ver 2.0購自TaKaRa公司。DNA片段快速純化回收試劑盒YNB購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司,一抗為兔抗-FSHβ及二抗為羊抗兔IgG-HRP購自武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品,F(xiàn)SH放免試劑盒購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。

        1.1.3 培養(yǎng)基

        LB培養(yǎng)基: 酵母抽提物5 g/L, 胰蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L; 酵母培養(yǎng)基YPD、BMGY、BMMY具體配參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊配制。

        1.2 方法

        1.2.1 畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαAFSHα,β的構(gòu)建1.2.1.1 引物合成 根據(jù)畢赤酵母載體pPICZαA多克隆位點處酶切位點的特點以及FSHα,β基因序列上信號肽序列的位置,設(shè)計去掉信號肽的引物Fα、Fβ,其中陰影部分為酶切位點。

        1.2.1.2 目的基因的擴增及重組到載體中 以pcDNA-FSHα,β為模板,用引物Fα、Fβ分別擴增出FSH的α和β亞基基因,F(xiàn)α的擴增條件為94℃預(yù)變性4 min;94℃變性45 s, 56.4℃退火30 s,72℃延伸45 s, 30個循環(huán);最后,72℃ 延伸2min;Fβ的擴增條件為94℃預(yù)變性4min;94℃變性45 s,60.6℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環(huán);最后,72℃延伸2min。將獲得的目的基因及載體純化后用EcoRI、Not I雙酶切后再次純化,利用DNALigation Kit Ver 2.0 16℃連接30min后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,提取陽性菌落的重組質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定,將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。

        1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中

        將測序檢測正確的重組載體p PICZαAFSHα、β,分別使用Sac I酶切線性化處理后純化回收,使其濃度達(dá)到0.5~1μg/μL,然后電擊共轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的畢赤酵母GS115中,電轉(zhuǎn)化參數(shù)為電壓1500 V,時間5ms,電轉(zhuǎn)化后將菌液涂到含有終濃度為100μg/mL的Zeocin的YPDS平板上,30℃培養(yǎng)2~3 d待菌落出現(xiàn)。

        1.2.3 陽性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)

        挑選陽性單菌落接種25mL的BMGY于250mL的搖瓶中,30℃300 r/min振蕩培養(yǎng)到OD600達(dá)到2~6,離心收集菌體然后重懸于100mL的BMMY于1 L的搖瓶中,30℃300 r/min誘導(dǎo)表達(dá),每24 h取1mL表達(dá)上清,同時加入100%的甲醇至終濃度為0.5%,取出的樣品最大轉(zhuǎn)速離心5min后,吸取上清-80℃保存待用。

        1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGA分析及W estern–blot檢測

        將-80℃保存的表達(dá)上清放于冰上解凍,取10μL蛋白樣品加入4XSDS加樣緩沖液混合后100℃煮沸1min,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析,濃縮膠為5%、分離膠為15%,電泳結(jié)束后硝酸銀進(jìn)行染色,并與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量比較,將剩余樣品進(jìn)行Western–blot檢測,具體操作見基因克隆理論與技術(shù)[6]。

        1.2.5 放射免疫檢測上清中目的蛋白的表達(dá)量

        將解凍的表達(dá)上清液,分別加入FSH抗體和I125-FSH,室溫放置16~18 h后加入分離劑,4000 r/min離心25min立即吸取上清液測定放射性計數(shù)(CPM),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度的CPM值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后計算不同CPM值的表達(dá)上清中目的蛋白的表達(dá)量。

        2 結(jié)果

        2.1 FSHα,β亞基基因的PCR擴增

        去掉信號肽序列后目的基因FSHα,β亞基大小分別為305 bp、350 bp,電泳顯示檢測的條帶與預(yù)期的大小相一致。

        圖1 FSHα,β基因的PCR擴增

        2.2 重組載體pPICZαAFSHα,β的酶切鑒定

        畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA大小為3.6 kb,目的基因FSHα,β亞基大小分別為305 bp、350 bp,電泳檢測得到的條帶與預(yù)期的大小一致。測序結(jié)果顯示目的基因編碼區(qū)沒有發(fā)生突變,見圖2。

        圖2 pPICZαA-FSHα, pPICZαA-FSHβ的雙酶切鑒定。M:DNA marker DL15 000

        2.3 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western–blot分析

        將誘導(dǎo)表達(dá)的上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,用硝酸銀進(jìn)行染色并與蛋白Marker比較后顯示在27 KD處有蛋白條帶的出現(xiàn)(見圖3);電泳顯示誘導(dǎo)表達(dá)48 h未見明顯蛋白的表達(dá),72 h開始有微弱的表達(dá)并隨著時間的延續(xù)表達(dá)量逐漸的增加。測定結(jié)果顯示168 h達(dá)到最大以后逐漸降低。Western–blot分析顯示27 KD處蛋白為FSHα,β表達(dá)的蛋白(見圖4)。

        圖3 SDS-PAGE分析FSHαβ基因不同時間的表達(dá)

        圖4 FSHα,β表達(dá)蛋白的 Western–blot 分析M: 蛋白Marker

        2.4 目的蛋白的放射免疫檢測(RIA)

        表達(dá)上清經(jīng)放射免疫檢測后,并用SPSS11.0分析后結(jié)果見圖5。

        圖5 FSHα,β基因表達(dá)蛋白的放射免疫檢測

        結(jié)果顯示試驗組pPICZαA-FSHα,β獲得的表達(dá)量顯著高于對照組。

        3 討論

        巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一個較好的被廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng),具有轉(zhuǎn)錄后加工修飾功能,遺傳操作簡單,成本低廉,適合于穩(wěn)定表達(dá)有功能的外源蛋白,而且可大規(guī)模的發(fā)酵,是最理想的重組真核蛋白生產(chǎn)制備工具。巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體分為自我復(fù)制型的游離載體和整合型載體,游離型載體能夠獨立于酵母染色體外自主復(fù)制,拷貝數(shù)通常可到30以上但不穩(wěn)定,在傳代過程中易丟失影響重組菌的穩(wěn)定性和表達(dá)量。整合型載體導(dǎo)入酵母中后與其染色體基因組DNA整合保證了蛋白生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性。本研究所用的載體pPICZαA為最近開發(fā)的整合型表達(dá)載體,是以ZeocinTM抗性基因作為主要的選擇標(biāo)記,可以對重組的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行直接和有效的篩選,可達(dá)到100%的ZeocinTM抗性轉(zhuǎn)化子都含有目的基因,沒有必要檢測插入的目的基因[7]。

        FSH是糖蛋白激素其糖基化必須在信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體后才能完成。此外,蛋白的正確構(gòu)象和翻譯后加工都是在分泌途中完成的。載體pPICZαA含有使用最為廣泛的α-交配因子的前導(dǎo)肽序列,Mital i samadda[8]等在對牛的FSHβ亞基進(jìn)行畢赤酵母表達(dá)時分別使用了FSHβ信號肽和α-交配因子的前導(dǎo)肽序列,并進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)當(dāng)同源FSHβ信號肽替代為α-交配因子的前導(dǎo)肽后,F(xiàn)SHβ的表達(dá)量獲得了顯著的提高,表達(dá)量從230 ng/mL提高到4μg/mL。本研究設(shè)計了去除FSH信號肽的引物,利用載體上的α-交配因子的前導(dǎo)肽獲得了較高的表達(dá),顯著地高于在細(xì)胞中的表達(dá)[9]。

        糖類是促性腺激素分子的重要組成成分,約占促性腺激素分子量的20%~30%[10],而FSH分子中大約含有16%的碳水化合物包括己糖、己糖胺、巖藻糖和唾液酸等。本研究表達(dá)的蛋白分子量為27 KD,F(xiàn)SHα,β預(yù)測的分子量為22.88 KD,加上糖基化的分子量與預(yù)期的結(jié)果相符合而沒有過度的糖基化,保證了目的蛋白的生物學(xué)活性和較小的抗原性。

        本研究首次在畢赤酵母中成功的表達(dá)了促卵泡素基因,為利用畢赤酵母大量生產(chǎn)重組的促卵泡素奠定了基礎(chǔ)。但對于重組FSH的提取、純化和生物活性尚需要進(jìn)一步的研究。

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