楊歡利,毛英姿,丁家桐

(1.浙江省臺州醫(yī)院 生殖中心，浙江 臺州 317000；2.揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

促卵泡素(FSH)是一種糖蛋白激素，對配子的發(fā)生、分化、成熟及與生殖有關(guān)行為的發(fā)生都起著重要的作用。在動物生殖過程中FSH與LH協(xié)同作用可促使雄性動物生精上皮發(fā)育和精子成熟，并可促使雌性動物卵泡成熟、抑制卵泡閉鎖、誘導(dǎo)芳香酶活性、刺激顆粒細(xì)胞增生及誘導(dǎo)促黃體素(LH)和催乳素(PRL)受體產(chǎn)生[1]。

目前，動物生產(chǎn)中用的FSH主要從各種家畜腦垂體組織純化而來的，垂體提取的FSH純度低，生物活性不穩(wěn)定，而且常不同程度地混雜有LH及其它潛在傳染性病原[2],其負(fù)作用較大,影響了FSH的廣泛應(yīng)用。利用基因工程可獲得純度較高的且不含LH的重組促卵泡素，而且生物活性穩(wěn)定[3,4]。重組FSH的應(yīng)用，可以改善超數(shù)排卵的效果，增加結(jié)果的可預(yù)見性，并且能夠優(yōu)化超排的程序。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是被廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有較強的乙醇氧化酶啟動子，可有效地控制外源蛋白的表達(dá)，其翻譯后的糖基化修飾、折疊、加工和分泌的環(huán)境使生產(chǎn)的蛋白具有天然的高級結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性，同時具有遺傳穩(wěn)定性強，可以發(fā)酵培養(yǎng)到較高的細(xì)胞濃度等優(yōu)點[5]。

本研究利用基因重組技術(shù)構(gòu)建FSH的酵母表達(dá)載體并電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，來檢測畢赤酵母表達(dá)載體在FSH表達(dá)中的應(yīng)用，為重組FSH激素的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株

質(zhì)粒pcDNAFSHα,β、大腸桿菌DH5α由本實驗室構(gòu)建和保存；畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA、畢赤酵母菌株GS115購自Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

限制酶EcoRI、Not I、Sac I, XhoI、XbaI，高保真聚合酶Pyrobest TM DNA Polymerase,DNA Ligation Kit Ver 2.0, MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0，DL2 000, DL15 000，Agarose Gel DNA Puri fication Kit Ver 2.0購自TaKaRa公司。DNA片段快速純化回收試劑盒YNB購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，一抗為兔抗-FSHβ及二抗為羊抗兔IgG-HRP購自武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品，F(xiàn)SH放免試劑盒購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基: 酵母抽提物5 g/L, 胰蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L; 酵母培養(yǎng)基YPD、BMGY、BMMY具體配參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊配制。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαAFSHα,β的構(gòu)建1.2.1.1 引物合成 根據(jù)畢赤酵母載體pPICZαA多克隆位點處酶切位點的特點以及FSHα,β基因序列上信號肽序列的位置，設(shè)計去掉信號肽的引物Fα、Fβ，其中陰影部分為酶切位點。

1.2.1.2 目的基因的擴增及重組到載體中 以pcDNA-FSHα,β為模板，用引物Fα、Fβ分別擴增出FSH的α和β亞基基因，F(xiàn)α的擴增條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s, 56.4℃退火30 s，72℃延伸45 s, 30個循環(huán)；最后，72℃ 延伸2min；Fβ的擴增條件為94℃預(yù)變性4min；94℃變性45 s，60.6℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后，72℃延伸2min。將獲得的目的基因及載體純化后用EcoRI、Not I雙酶切后再次純化，利用DNALigation Kit Ver 2.0 16℃連接30min后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取陽性菌落的重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中

將測序檢測正確的重組載體p PICZαAFSHα、β，分別使用Sac I酶切線性化處理后純化回收，使其濃度達(dá)到0.5～1μg/μL,然后電擊共轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的畢赤酵母GS115中，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為電壓1500 V，時間5ms，電轉(zhuǎn)化后將菌液涂到含有終濃度為100μg/mL的Zeocin的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d待菌落出現(xiàn)。

1.2.3 陽性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)

挑選陽性單菌落接種25mL的BMGY于250mL的搖瓶中，30℃300 r/min振蕩培養(yǎng)到OD600達(dá)到2～6，離心收集菌體然后重懸于100mL的BMMY于1 L的搖瓶中，30℃300 r/min誘導(dǎo)表達(dá)，每24 h取1mL表達(dá)上清，同時加入100%的甲醇至終濃度為0.5%，取出的樣品最大轉(zhuǎn)速離心5min后，吸取上清－80℃保存待用。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGA分析及W estern–blot檢測

將－80℃保存的表達(dá)上清放于冰上解凍，取10μL蛋白樣品加入4XSDS加樣緩沖液混合后100℃煮沸1min，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析，濃縮膠為5%、分離膠為15%，電泳結(jié)束后硝酸銀進(jìn)行染色，并與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量比較，將剩余樣品進(jìn)行Western–blot檢測，具體操作見基因克隆理論與技術(shù)[6]。

1.2.5 放射免疫檢測上清中目的蛋白的表達(dá)量

將解凍的表達(dá)上清液，分別加入FSH抗體和I125－FSH，室溫放置16～18 h后加入分離劑，4000 r/min離心25min立即吸取上清液測定放射性計數(shù)(CPM)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度的CPM值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算不同CPM值的表達(dá)上清中目的蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 FSHα,β亞基基因的PCR擴增

去掉信號肽序列后目的基因FSHα,β亞基大小分別為305 bp、350 bp，電泳顯示檢測的條帶與預(yù)期的大小相一致。

圖1 FSHα,β基因的PCR擴增

2.2 重組載體pPICZαAFSHα,β的酶切鑒定

畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA大小為3.6 kb，目的基因FSHα,β亞基大小分別為305 bp、350 bp，電泳檢測得到的條帶與預(yù)期的大小一致。測序結(jié)果顯示目的基因編碼區(qū)沒有發(fā)生突變，見圖2。

圖2 pPICZαA-FSHα, pPICZαA-FSHβ的雙酶切鑒定。M：DNA marker DL15 000

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western–blot分析

將誘導(dǎo)表達(dá)的上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，用硝酸銀進(jìn)行染色并與蛋白Marker比較后顯示在27 KD處有蛋白條帶的出現(xiàn)(見圖3)；電泳顯示誘導(dǎo)表達(dá)48 h未見明顯蛋白的表達(dá)，72 h開始有微弱的表達(dá)并隨著時間的延續(xù)表達(dá)量逐漸的增加。測定結(jié)果顯示168 h達(dá)到最大以后逐漸降低。Western–blot分析顯示27 KD處蛋白為FSHα,β表達(dá)的蛋白(見圖4)。

圖3 SDS-PAGE分析FSHαβ基因不同時間的表達(dá)

圖4 FSHα,β表達(dá)蛋白的 Western–blot 分析M: 蛋白Marker

2.4 目的蛋白的放射免疫檢測(RIA)

表達(dá)上清經(jīng)放射免疫檢測后，并用SPSS11.0分析后結(jié)果見圖5。

圖5 FSHα,β基因表達(dá)蛋白的放射免疫檢測

結(jié)果顯示試驗組pPICZαA-FSHα,β獲得的表達(dá)量顯著高于對照組。

3 討論

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一個較好的被廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有轉(zhuǎn)錄后加工修飾功能，遺傳操作簡單，成本低廉，適合于穩(wěn)定表達(dá)有功能的外源蛋白，而且可大規(guī)模的發(fā)酵，是最理想的重組真核蛋白生產(chǎn)制備工具。巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體分為自我復(fù)制型的游離載體和整合型載體，游離型載體能夠獨立于酵母染色體外自主復(fù)制，拷貝數(shù)通常可到30以上但不穩(wěn)定，在傳代過程中易丟失影響重組菌的穩(wěn)定性和表達(dá)量。整合型載體導(dǎo)入酵母中后與其染色體基因組DNA整合保證了蛋白生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性。本研究所用的載體pPICZαA為最近開發(fā)的整合型表達(dá)載體，是以ZeocinTM抗性基因作為主要的選擇標(biāo)記，可以對重組的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行直接和有效的篩選，可達(dá)到100%的ZeocinTM抗性轉(zhuǎn)化子都含有目的基因，沒有必要檢測插入的目的基因[7]。

FSH是糖蛋白激素其糖基化必須在信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體后才能完成。此外，蛋白的正確構(gòu)象和翻譯后加工都是在分泌途中完成的。載體pPICZαA含有使用最為廣泛的α－交配因子的前導(dǎo)肽序列，Mital i samadda[8]等在對牛的FSHβ亞基進(jìn)行畢赤酵母表達(dá)時分別使用了FSHβ信號肽和α－交配因子的前導(dǎo)肽序列，并進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)同源FSHβ信號肽替代為α－交配因子的前導(dǎo)肽后，F(xiàn)SHβ的表達(dá)量獲得了顯著的提高，表達(dá)量從230 ng/mL提高到4μg/mL。本研究設(shè)計了去除FSH信號肽的引物，利用載體上的α－交配因子的前導(dǎo)肽獲得了較高的表達(dá)，顯著地高于在細(xì)胞中的表達(dá)[9]。

糖類是促性腺激素分子的重要組成成分，約占促性腺激素分子量的20%～30%[10]，而FSH分子中大約含有16%的碳水化合物包括己糖、己糖胺、巖藻糖和唾液酸等。本研究表達(dá)的蛋白分子量為27 KD，F(xiàn)SHα,β預(yù)測的分子量為22.88 KD，加上糖基化的分子量與預(yù)期的結(jié)果相符合而沒有過度的糖基化，保證了目的蛋白的生物學(xué)活性和較小的抗原性。

本研究首次在畢赤酵母中成功的表達(dá)了促卵泡素基因，為利用畢赤酵母大量生產(chǎn)重組的促卵泡素奠定了基礎(chǔ)。但對于重組FSH的提取、純化和生物活性尚需要進(jìn)一步的研究。

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