吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 王桂芹 李子平 牛小天

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 蘆洪梅 韓宇田

農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 趙朝陽

生長(zhǎng)是生物體通過同化作用進(jìn)行物質(zhì)積累、細(xì)胞分裂或增殖的體積增大，動(dòng)物真生長(zhǎng)是結(jié)構(gòu)、組織如肌肉、骨骼、器官的體積、蛋白質(zhì)量的增加，所以生長(zhǎng)多以體蛋白變化來表示（Perez，1995）。魚類的生長(zhǎng)實(shí)際上是通過蛋白質(zhì)合成完成的，RNA/DNA與蛋白質(zhì)合成、魚類生長(zhǎng)速度之間具有相關(guān)性，所以RNA/DNA比率能夠迅速地反映魚類當(dāng)前營(yíng)養(yǎng)狀況的變化，從而在較短的時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地評(píng)定飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。魚類對(duì)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝受到酶、激素和基因的調(diào)控。硬骨魚類的生長(zhǎng)與其他脊椎動(dòng)物一樣，也受到腦-腦垂體-肝臟生長(zhǎng)軸的調(diào)控。許多研究表明，飼料通過影響魚類激素的分泌而調(diào)控生長(zhǎng)，如飼料蛋白攝入數(shù)量和質(zhì)量等（Gomez等，2004；Marti等，1996）。 但有關(guān)飼料能量和維生素B6對(duì)魚類蛋白質(zhì)合成與調(diào)控的影響報(bào)道較少（Eales等，1992）。本試驗(yàn)以烏鱧為試驗(yàn)對(duì)象，選取飼料能量和維生素B6兩個(gè)重要的蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控因素，即探討飼料能量和維生素B6分別與蛋白質(zhì)的交互作用對(duì)烏鱧蛋白質(zhì)合成與調(diào)控的影響，以期為進(jìn)一步闡明蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制，為生產(chǎn)上優(yōu)化烏鱧飼料配方，提高產(chǎn)量，降低成本提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料 以魚粉為蛋白源，以魚油、大豆油、糊精和面粉為能源、吡哆醇鹽酸鹽（Sigma）為維生素B6的來源（用前進(jìn)行包膜處理）、纖維素為填充物配制半精制日糧。試驗(yàn)日糧為由3個(gè)蛋白水平（含34.7%、38.3%和41.8%可消化蛋白）和3個(gè)能量水平（14.5、16.0 MJ和17.5 MJ的可消化能）組合而成的9種配合飼料。試驗(yàn)配方及其營(yíng)養(yǎng)組成如表1所示，其中L、M和H分別表示3個(gè)蛋白質(zhì)水平，數(shù)字1、2、3分別表示3個(gè)能量水平。試驗(yàn)二共配制成由3個(gè)蛋白水平（34.7%、38.3%和 41.8%）和 3個(gè)維生素 B6水平（6、18 mg/kg和30 mg/kg飼料）組合而成的9種配合飼料。試驗(yàn)配方及其組成如表2所示，其中L、M和H分別代表3個(gè)蛋白質(zhì)水平，數(shù)字1、2、3分別代表3個(gè)維生素B6水平。飼料經(jīng)制粒 （1.5 mm），曬干后置于-4℃冰柜中保存、備用。

1.2 飼養(yǎng)管理 生長(zhǎng)試驗(yàn)于2008年7月25日到2008年9月23日在安西水庫池塘網(wǎng)箱（1 m×1 m×1 m）中進(jìn)行，烏鱧魚苗購(gòu)于沈陽蘇家屯，飼養(yǎng)于土池中2個(gè)月，試驗(yàn)前2 w挑選規(guī)格整齊1000尾魚置于網(wǎng)箱中進(jìn)行馴養(yǎng)，期間從冰鮮雜魚逐漸過渡到配合飼料。待全部攝食配合飼料后，試驗(yàn)開始前先停食24 h，稱重，隨后從馴養(yǎng)魚中每次隨機(jī)取30尾魚，每種飼料 3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)30尾魚，持續(xù)飼養(yǎng)8 w。試驗(yàn)開始時(shí)從馴養(yǎng)魚中隨機(jī)取10尾稱重。試驗(yàn)期間記錄死魚并稱重，在試驗(yàn)結(jié)束前停食24 h，每個(gè)重復(fù)稱重，計(jì)算特定生長(zhǎng)率。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 DNA、RNA含量的測(cè)定 生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，將魚饑餓1 d，從每個(gè)飼料組中隨機(jī)取烏鱧10尾，吸干體表水分，在每尾魚的背鰭基部取白肌和肝胰臟作為一個(gè)樣品，并于-20℃保存待測(cè)。具體方法如下：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定： 配制濃度為 0、5、10、15、20 μg/mL和25 μg/mL的RNA標(biāo)準(zhǔn)液，濃度為 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 μg/mL 和 15.0 μg/mL DNA標(biāo)準(zhǔn)液。分別在260 nm和265 nm處測(cè)定RNA和DNA的吸收值（OD），RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0507x+0.0054 （R2=0.9997），DNA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0177x+0.0006 （R2=0.9984），x 分別為 RNA 和DNA含量（μg/mL），y為RNA或DNA的OD值。

樣品中核酸的測(cè)定：取0.5000～1.0000 g魚白肌或肝胰臟，剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入適量冷的0.01 mol/L檸檬酸三鈉勻漿，制備RNA和DNA原液。同上測(cè)定其OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得核酸的含量并計(jì)算。

1.3.2 IGF-I的測(cè)定 生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)飼料組中隨機(jī)取烏鱧10尾，MS-222（100 mg/L）麻醉，用一次性醫(yī)用注射器從尾靜脈取血，肝素抗凝，4℃靜置 24 h后，2500 r/min離心 10 min，分離血漿，-20℃保存?zhèn)溆?。烏鱧血漿用酸醇處理，去除結(jié)合蛋白。取40 μL血清，加入360 μL酸醇液，混均，25℃放置30 min，10000轉(zhuǎn) 4℃離心20 min，取上清0.2 mL，加入0.1 mLTris混均、離心，取上清液待測(cè)。烏鱧血清IGF-I含量采用IGF-I平衡飽和競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析（RIA）法進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自中國(guó)九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司（中國(guó)，天津）。用放免γ測(cè)量?jī)x進(jìn)行計(jì)數(shù)，檢測(cè)范圍為1.25～100 ng/mL。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干質(zhì)量）

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。生長(zhǎng)、核酸含量和血中IGF-I分別進(jìn)行雙變量相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 飼料能量與蛋白質(zhì)的交互作用對(duì)烏鱧蛋白質(zhì)合成與調(diào)控的影響 蛋白質(zhì)和能量對(duì)烏鱧肌肉核酸和血中IGF-1含量的影響見表3。飼料蛋白質(zhì)水平極顯著影響烏鱧的RNA/DNA比率 （P＜0.01），顯著影響RNA含量（P＜0.05）。在同一能量水平下，烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量均隨飼料蛋白含量先升高后下降。能量水平極顯著地影響烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量 （P＜0.01）。在同一蛋白水平下，烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量均隨飼料能量含量先升高后下降，蛋能比對(duì)烏鱧的RNA/DNA比率、RNA含量及DNA含量影響均不顯著（P＞0.05）。飼料蛋白質(zhì)和能量水平顯著影響烏鱧血清IGF-I的含量（P＜0.05），IGF-I的含量均隨飼料蛋白質(zhì)和能量水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。蛋能比對(duì)烏鱧的IGF-I的含量影響不顯著（P＞0.05）。核酸和血清中IGF-I與生長(zhǎng)顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.943*和0.876*。

表2 試驗(yàn)飼料配方及其營(yíng)養(yǎng)組成（干質(zhì)量）

2.2 飼料中維生素B6與蛋白質(zhì)的交互作用對(duì)烏鱧蛋白質(zhì)合成與調(diào)控的影響 蛋白質(zhì)與維生素B6對(duì)核酸含量和血中IGF-1的影響見表4。飼料蛋白質(zhì)水平極顯著影響烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量（P＜0.01），隨著蛋白質(zhì)水平的增加，烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量呈先升高后穩(wěn)定的趨勢(shì)。維生素B6極顯著影響烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量（P＜0.01）。在低和中蛋白質(zhì)水平下，隨著維生素B6的添加，高劑量維生素B6組的RNA/DNA比率顯著增加（P＜0.05），高蛋白組維生素B6對(duì)烏鱧的RNA/DNA比率影響不顯著（P＞0.05）。在中和高蛋白水平下，隨著維生素B6的添加，RNA含量有增加的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05），在低蛋白組，添加高維生素B6組的RNA含量顯著增加（P＜0.05），低添加量時(shí)與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），飼料蛋白質(zhì)和維生素B6水平及其交互作用對(duì)烏鱧的DNA含量均無顯著影響（P＞0.05）。飼料蛋白質(zhì)水平極顯著影響烏鱧血清IGF-I的含量 （P＜0.01），除H3組外IGF-I的含量均隨飼料蛋白質(zhì)和維生素B6含量升高而升高，維生素B6及蛋白質(zhì)與維生素B6交互作用對(duì)其影響不顯著。核酸和血清中IGF-I與生長(zhǎng)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.886*和0.834*。

3 討論

表3 飼料能量與蛋白質(zhì)的交互作用對(duì)烏鱧生長(zhǎng)、核酸與IGF-I含量的影晌

白肌是魚類蛋白質(zhì)合成用于沉積最高的組織，是表達(dá)魚體生長(zhǎng)最有代表性的組織。魚類的生長(zhǎng)主要是通過蛋白質(zhì)的合成來實(shí)現(xiàn)的，真核生物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成是核酸數(shù)量和活性功能的體現(xiàn)（Higucra等，1999）。RNA/DNA 表示核糖體的數(shù)量或蛋白質(zhì)的合成潛力或RNA的轉(zhuǎn)錄效率，亦是衡量組織蛋白質(zhì)合成能力的指標(biāo)，對(duì)翹嘴鲌（王桂芹等，2008）、虹鱒（Mathers 等，1993）、大菱鲆（Imsland等，2002）的研究表明，RNA/DNA不僅與魚體的生長(zhǎng)有關(guān)，也與魚類的營(yíng)養(yǎng)狀況有關(guān)。本試驗(yàn)表明烏鱧肌肉的RNA/DNA與其生長(zhǎng)正相關(guān)。魚類對(duì)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝受到腦-腦垂體-肝臟生長(zhǎng)軸的調(diào)控，生長(zhǎng)激素的促生長(zhǎng)效應(yīng)主要是由IGF-I介導(dǎo)的，IGF-I是一種廣譜性促細(xì)胞分裂素，能促進(jìn)鳥氨酸脫氫酶的活性及細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的生物合成，最終引起細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和結(jié)締組織及骨髓的產(chǎn)生（Tsai等，1995）。 大西洋鮭和尖吻鱸 （Anthony等，2004）、金頭鯛（Perez等，1995）血漿 IGF-I濃度變化與生長(zhǎng)正相關(guān)，本研究也得到同樣的結(jié)果。表明肌肉核酸和血清IGF-I是衡量蛋白質(zhì)合成和調(diào)控且反映魚類生長(zhǎng)速度的重要參數(shù)之一。

蛋白質(zhì)合成能力和血IGF-I的分泌受到生長(zhǎng)階段、飼料營(yíng)養(yǎng)狀況的影響與調(diào)控。對(duì)虹鱒（Mathers等，1993）、大菱鲆（Imsland 等，2002）的研究表明，快速生長(zhǎng)發(fā)育期的魚類蛋白質(zhì)合成能力可作為魚類生長(zhǎng)的衡量指標(biāo)。研究表明，飼料蛋白質(zhì)水平的增加促進(jìn)白肌蛋白質(zhì)合成能力和生長(zhǎng)是通過增加RNA/DNA和IGF-I來實(shí)現(xiàn)的。對(duì)翹嘴鲌（王桂芹等，2008）、鯉魚（Higucra 等，1998）的研究表明，飼料氨基酸的平衡程度對(duì)生長(zhǎng)影響是通過蛋白質(zhì)合成能力和IGF-I來調(diào)控的，但華益民和林浩然（2001）研究不同飼料蛋白水平對(duì)鯉魚內(nèi)分泌的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同蛋白質(zhì)水平對(duì)IGF-ImRNA無顯著影響，可能是因?yàn)镮GF-I表達(dá)的調(diào)節(jié)是一個(gè)相對(duì)緩慢的過程，試驗(yàn)時(shí)間只有30 d的緣故。本試驗(yàn)表明蛋白質(zhì)是調(diào)控RNA/DNA和IGF-I的合成的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。關(guān)于飼料能量和維生素B6對(duì)魚類RNA/DNA和IGF-I的影響未見報(bào)道。本試驗(yàn)適宜蛋能比（23.3 g/MJ）通過提高血中IGF-I的含量來調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，從而促進(jìn)生長(zhǎng)，這與對(duì)真鯛（Marti等，1996）和虹鱒（Eales等，1992）的研究結(jié)果一致，即適宜蛋能比能促進(jìn)激素的分泌，從而促進(jìn)生長(zhǎng)。本試驗(yàn)說明可消化蛋白質(zhì)水平在34.5%～42.0%時(shí)，飼料中增加維生素B6（18～30 mg/kg）的添加量，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，提高血中IGF-I的含量從而促進(jìn)生長(zhǎng)。這與在虹鱒（Smith等，1974）和羅非魚（Liral等，1995）餌料中應(yīng)添加足量的維生素B6，可提高蛋白質(zhì)的沉積率研究結(jié)果一致。在飼料低蛋白質(zhì)水平條件下，蛋白質(zhì)中含氮化合物的代謝強(qiáng)度較低，對(duì)飼料中維生素B6的需求量也較低；在飼料高蛋白質(zhì)水平下將增加機(jī)體對(duì)維生素B6的需要量，所以一定水平飼料蛋白質(zhì)需要一定量的飼料維生素B6作為其代謝過程中輔酶的前體來促進(jìn)生長(zhǎng)。

表4 飼料中維生素B6與蛋白質(zhì)的交互作用對(duì)烏鱧生長(zhǎng)、核酸與IGF-I含量的影晌

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