王新帥，秦 玲，馮笑山，高社干，祁巖超

大量研究顯示腫瘤患者免疫功能低下，腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別［1］。樹突狀細(xì)胞(DCs)是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者。通過外源的腫瘤抗原負(fù)荷DCs增強(qiáng)其免疫性及抗原遞呈作用，以DC 為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療已成為當(dāng)今腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。本研究采用負(fù)荷CEA-rV 負(fù)荷臍血來源的DC 后，再與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced kill cell，CIK)混合培養(yǎng)，觀察CEA－rV－DC－CIK 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo 的殺傷活性，從而為CEA 陽性表達(dá)腫瘤細(xì)胞免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 IL-2、IFN-γ、GM-CSF(grannulocyte monocyte-colony stimulating factor)、TNF-α 及CD3 單抗購自美國Cytolab 公司;PGE2(Prostaglandin E2)購自美國Cayman 公司;鼠抗人CD40、CD80、CD83、CD86 熒光抗體購自美國eBioscience 公司;RPMI 1640 購自美國Gibco 公司;MTT 購自美國Sigma 公司;新生小牛血清購自杭州四季青生物公司;淋巴細(xì)胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所;蛋白提取試劑盒購自中國康成生物公司;人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo 由廣州醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供;酶標(biāo)儀為美國Thermo Labsystem 生產(chǎn)的MK3 型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CEA-rV 的制備及滴度測(cè)定 CEA-rV 的制備及滴度測(cè)定依照參考文獻(xiàn)［2］中方法進(jìn)行，進(jìn)行滴度測(cè)定后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 臍血的采集和分離 臍血樣本來自廣州市荔灣醫(yī)院，共10 份。其孕母HBV、HCV、HIV 和梅毒檢測(cè)陰性。用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞(cord blood mononuclear cells，CBMC)。

1.2.3 DC 和CIK 的誘導(dǎo) ①DC 的誘導(dǎo):取分離的CBMC 置入6 孔培養(yǎng)板，2 h 后吸出懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞中加入20 ng/mL IL-4 和100 ng/mL GM-CSF，隔天換液，誘導(dǎo)培養(yǎng)前期加入CEA-rV，后期加入20 ng/mL TNF-α 和1 μg/mL PGE2。②CIK 的誘導(dǎo):懸浮細(xì)胞中加入1 000 μg/mL IFN-γ、500 ng/mL CD3單抗、200 μg/mL IL-2，每2 ～3 d 傳代培養(yǎng)1 次，傳代時(shí)補(bǔ)加細(xì)胞因子。

1.2.4 DC 的形態(tài)和免疫學(xué)鑒定 應(yīng)用倒置顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡鑒定成熟DC 的形態(tài)。采用流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)的Cellquest 軟件分析成熟DC 的免疫學(xué)CD 分子表型，加鼠抗人CD40、CD80、CD83、CD86 熒光抗體及其對(duì)照品，4℃避光標(biāo)記30 min 后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分4 組:①CBMC 組:未經(jīng)誘導(dǎo)的CBMC;②CIK 組:未經(jīng)腫瘤抗原刺激的CIK;③DC-CIK 組:DC 與CIK 混合培養(yǎng);④CEA-rV-DCCIK 組:負(fù)載CEA-rV 的DC 和CIK 按1∶10 的比例混合培養(yǎng)。

1.2.6 各組細(xì)胞殺傷活性的測(cè)定 將各組效應(yīng)細(xì)胞與Lovo 細(xì)胞按10∶1 的比例放入96 孔板，另設(shè)單獨(dú)Lovo 細(xì)胞組和單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，應(yīng)用MTT 法［3］在酶標(biāo)儀上測(cè)定各組細(xì)胞在570 nm 處吸光度(A)值，取3 個(gè)復(fù)孔的均值作為測(cè)定結(jié)果，殺傷活性的計(jì)算公式:殺傷活性(%)=［(靶細(xì)胞OD 值+效應(yīng)細(xì)胞OD 值－實(shí)驗(yàn)組OD 值)/靶細(xì)胞OD 值］×100%。

2 結(jié)果

2.1 DC 的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 在培養(yǎng)前3 d 大部分DC 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則改變，少量細(xì)胞懸浮并可見少量突起。加入TNF-α 和PGE2后，大量細(xì)胞懸浮，突起明顯增多。培養(yǎng)10 d 的成熟DC 表面有大量突起和明顯的偽足，表面凸凹不平(圖1A)。透射電鏡顯示細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿豐富，見多個(gè)線粒體和電子密度高低不均的大量溶酶體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生活躍及大量的吞噬小體(圖1B)。掃描電鏡可見DC 的胞體呈多角形、橢圓形、圓形，表面有大量的片狀突起和長(zhǎng)的突起，其突起又有細(xì)小的分枝，分枝末端又可分成細(xì)小的絲狀偽足(圖1C)。

圖1 成熟DC 的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.2 DC 的免疫分子表型結(jié)果 成熟DC 表達(dá)主要組織相容性抗原Ⅰ、Ⅱ類分子CD86、CD80、CD83 和CD40，其中高表達(dá)CD86 和CD40，中度表達(dá)CD83 和CD80，表達(dá)率分別為(82. 66 ±6. 22)%、(69. 40 ±6.82)%、(57.49 ±6.59)%和(51.14 ±6.31)%，流式細(xì)胞儀Cellquest 軟件對(duì)DC 免疫分子表型的分析結(jié)果見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀對(duì)DC 免疫分子表型的分析結(jié)果

2.3 各組細(xì)胞對(duì)Lovo 細(xì)胞株的殺傷結(jié)果 CBMC組、CIK 組、DC-CIK 組、Ag-DC-CIK 組對(duì)靶細(xì)胞Lovo的殺傷活性分別為29. 31%、42.12%、44. 81% 和58.98%;單因素方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.169，P =0.001);其中CEA-rv-DC-CIK 組對(duì)Lovo 的殺傷活性比另外3 組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。具體結(jié)果見表1。

表1 各組細(xì)胞對(duì)Lovo 細(xì)胞株的殺傷結(jié)果(±s，%)

表1 各組細(xì)胞對(duì)Lovo 細(xì)胞株的殺傷結(jié)果(±s，%)

①任兩組比較P ＜0.05

分 組 n 殺傷活性CBMC 組 10 29.31 ±5.63①CIK 組 10 42.12 ±3.92①DC-CIK 組 10 44.81 ±4.24①CEA-rV-DC-CIK 組 10 58.98 ±7.36①F 值 25.169 P 值0.001

3 討論

腫瘤病人免疫功能低下，在腫瘤微環(huán)境影響下DC 功能受抑，腫瘤病人的樹突狀細(xì)胞(DCs)存在免疫功能缺陷，不能引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)［4，5］。MHC 限制性又嚴(yán)重影響異體DCs 輸注治療腫瘤的臨床應(yīng)用。臍血細(xì)胞免疫原性弱，含大量造血干細(xì)胞。如果從臍血中培養(yǎng)腫瘤抗原特異性的DCs，用于治療腫瘤，將會(huì)大大促進(jìn)DCs 免疫治療腫瘤的臨床應(yīng)用［6］。CEA-rV 是用天壇株761 痘苗病毒為截體，以CEA 抗原DNA 為目的基因構(gòu)建的既有CEA抗原的高表達(dá)，又可刺激機(jī)體產(chǎn)生CEA 抗體的重組基因痘苗病毒，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，單用CEA-rV 皮下注射，對(duì)CEA 陽性的腫瘤有明顯的預(yù)防和治療作用［7］。

本研究中將CBMC 誘導(dǎo)分化為DC，并對(duì)成熟DC 進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定。當(dāng)DC 在加入TNF-α 和PGE2 后，大量細(xì)胞懸浮，突起明顯增多，細(xì)胞表面有大量突起和明顯的偽足，表面凸凹不平。透射電鏡可見胞漿豐富，多個(gè)線粒體和大量溶酶體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生活躍及大量的吞噬小體。掃描電鏡可見細(xì)胞表面有大量的片狀突起和長(zhǎng)的突起，其突起又有細(xì)小的分枝，分枝末端又可分成細(xì)小的絲狀偽足。免疫學(xué)鑒定顯示成熟DC 高度表達(dá)CD86 和CD40，中度表達(dá)CD83 和CD80，CD86 是DC 成熟的重要標(biāo)志，表達(dá)率為82. 66%。本研究結(jié)果顯示CEA-rVDC-CIK 組比其余各組的殺傷活性高，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。說明經(jīng)CEA-rV 抗原負(fù)載的DC 與CIK 混合培養(yǎng)后，成熟的DC 以MHC 限制的方式處理CEA 抗原，并將該信號(hào)呈遞給CIK，從而增強(qiáng)了特異性CIK 對(duì)CEA 陽性表達(dá)腫瘤Lovo 細(xì)胞株的特異識(shí)別和殺傷能力。

綜上所述，經(jīng)CEA-rV 負(fù)荷CBMC 誘導(dǎo)生成的DC，能進(jìn)一步激活CIK，對(duì)Lovo 細(xì)胞株產(chǎn)生高效而特異的殺傷作用，其殺傷活性明顯高于CIK 和DC-CIK，為CEA 陽性表達(dá)腫瘤的細(xì)胞免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。此外臍血是一個(gè)較好的CIK 的來源，又因臍血來源豐富，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)易于控制，這也為CIK免疫治療技術(shù)的常規(guī)臨床應(yīng)用提供了方便。

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