潘海曉, 劉海順, 王 靜, 趙 冰, 蘇 穎

玉米是世界三大糧食作物之一,它含有較多的酚類化合物,如:阿魏酸、香草酸和香豆酸等.酚酸都有很強(qiáng)的抗氧化活性,對(duì)于延緩人體衰老有顯著的作用.玉米麩皮中主要含有阿魏酸,其含量為0.4%～3.6%[1-3].在植物中,阿魏酸主要通過酯鍵與細(xì)胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián),自身酯化或醚化形成雙阿魏酸.與其他植物細(xì)胞壁不同的是,玉米麩皮表面存在大量的纖維素、半纖維素,這嚴(yán)重影響酶解效率,而且研究發(fā)現(xiàn),玉米麩皮中的阿魏酰低聚糖的結(jié)構(gòu)也相當(dāng)復(fù)雜[4-9].

阿魏酰低聚糖(feruloylated oligosaccharides,FOs)是低聚糖中不同位置上的糖羥基與阿魏酸羧基酯化形成的一類化合物.阿魏酰低聚糖由于既具有阿魏酰基又具有親水性的低聚糖基團(tuán),因而具有較好的水溶性和耐熱性.近年來,雖然人們對(duì)天然抗氧化劑的研究比較多,但由于許多天然抗氧化劑不溶于水、不耐熱,因此阿魏酰低聚糖的生物活性已經(jīng)引起了人們的研究興趣.研究發(fā)現(xiàn),阿魏酰低聚糖的抗氧化性高于阿魏酸與VC,而且它可以體外抑制Cu2+誘導(dǎo)人體脂蛋白的過氧化反應(yīng),保護(hù)正常小鼠紅細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的傷害,是一種潛在的抗氧化劑[10-15].

本研究用廉價(jià)的玉米麩皮作原料,制備具有生理功能的阿魏酰低聚糖,以期為玉米加工副產(chǎn)物玉米麩皮的綜合利用提供一條新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米麩皮,中儲(chǔ)糧北京分公司承德糧油質(zhì)檢中心,粉碎后過40目篩待用;耐高溫α-淀粉酶,北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司;糖化酶,北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司;堿性蛋白酶,諾維信公司;木聚糖酶,武漢新華揚(yáng)生物有限公司;纖維素酶,北京寧馨兒生物科技開發(fā)有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析級(jí).

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-82型水浴恒溫振蕩器,江蘇省金壇市榮華制造有限公司;HH SY11-Ni2B型電熱恒溫水浴鍋,北京市長風(fēng)儀器公司;JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器,常州國華電器有限公司;Spectrumlab 53型紫外-可見分光光度計(jì),上海棱光技術(shù)有限公司;SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玉米麩皮不溶性膳食纖維制備

在文獻(xiàn)[15]和文獻(xiàn)[16]制備玉米膳食纖維方法的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了修改:玉米麩皮100 g用粉碎機(jī)粉碎后,過40目篩,用高壓蒸氣在121℃處理,后取出加入1 000 mL餾水,60℃下攪拌20 h,使其充分溶脹.加入耐高溫α-淀粉酶、堿性蛋白酶和糖化酶將玉米麩皮酶解,將混合物沉淀,棄去上清液,用熱水,冷水清洗沉淀,至上清液無明顯混濁,再用酒精和丙酮洗滌,最后放置在真空干燥箱內(nèi)45℃晾干.

1.3.2 玉米不溶性膳食纖維中阿魏酸含量的測(cè)定

10 mg玉米不溶性膳食纖維加入0.5 mL 2 mol·L-1氫氧化鈉,在搖床里反應(yīng) 2 h,轉(zhuǎn)速 150 r/min,后加入0.3 mL 3.5 mol·L-1的磷酸調(diào) pH 值到2.0.用乙酸乙酯萃取5次,每次加入乙酸乙酯1.6 mL,離心5 min,轉(zhuǎn)速1 000 g,上清液被放置在真空干燥箱內(nèi)45℃晾干,在325 nm下用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光值.

1.3.3 阿魏酰低聚糖的酶解工藝

建立旅游文化分享小課堂，學(xué)生可自由選擇自己感興趣的旅游相關(guān)知識(shí)，如自己關(guān)注的旅游相關(guān)新聞、導(dǎo)游常用的活躍氣氛小技能等，主要目的是促進(jìn)學(xué)生積極參與課程學(xué)習(xí)，鍛煉語言表達(dá)能力，營造良好的課程學(xué)習(xí)氛圍。

分別以纖維素酶、木聚糖酶濃度、反應(yīng)時(shí)間、底物濃度為變量,先后進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn),探索得到利用玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖的最優(yōu)條件.

1.3.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1)最適反應(yīng)時(shí)間的確定.稱取3 g玉米不溶性膳食纖維到100 mL三角瓶中,加入0.12 g木聚糖酶和0.24 g纖維素酶,再加入30 mL MOPS緩沖液(50 mmol/L,pH值為5.0),反應(yīng)混合物置于一臺(tái)恒溫水浴搖床內(nèi),60℃下分別反應(yīng)12,24,36,48,60 h,振蕩器轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min.

2)最適纖維素酶量的確定.稱取3 g玉米不溶性膳食纖維到100 mL三角瓶中,加入0.12 g木聚糖酶,再分別加入0.12,0.18,0.24,0.30,0.36 g纖維素酶,后加入30 mL MOPS緩沖液(50 mmol/L,pH值為5.0),反應(yīng)混合物置于一臺(tái)恒溫水浴搖床內(nèi),60℃下反應(yīng)36 h,振蕩器轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min.

3)最適木聚糖酶量的確定.稱取3 g玉米不溶性膳食纖維到100 mL三角瓶中,加入0.24 g纖維素酶,再分別加入0.06,0.12,0.18,0.24,0.30 g木聚糖酶,后加入30 mL醋酸緩沖液,反應(yīng)混合物置于一臺(tái)恒溫水浴搖床內(nèi),60℃下反應(yīng)48 h,振蕩器轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min.

4)最適底物濃度的確定.分別稱取1～5 g玉米不溶性膳食纖維到100 mL容量瓶中,加入0.3 g纖維素酶和0.3 g木聚糖酶,再加入30 mL pH值為5.0的醋酸緩沖液,反應(yīng)混合物置于一臺(tái)恒溫水浴搖床內(nèi),60℃下反應(yīng)36 h,振蕩器轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min.

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

為了探索酶解玉米麩皮獲得阿魏酰低聚糖的最佳條件,參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用正交表L9(43)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),試驗(yàn)的因素水平見表1.

表1 玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Design of orthogonal test in preparation of feruloyl oligosaccharides from maize bran

將酶解后的物質(zhì)從恒溫水浴搖床取出后,在高壓鍋內(nèi)100℃滅酶活10 min,后進(jìn)行抽濾,收集濾液,并將濾液過0.45μm超濾膜,將得到的液體采用雙波長法在286 nm和325 nm下測(cè)定其吸光值,計(jì)算得到阿魏酰低聚糖的濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米麩皮膳食纖維制備阿魏酰低聚糖的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響如圖1.由圖1可以看出,隨著時(shí)間的增加,阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量逐漸增加,反應(yīng)36 h,產(chǎn)量達(dá)到了最大值,之后隨著時(shí)間的增加,阿魏酰低聚糖產(chǎn)量有所下降,反應(yīng)50 h后趨于平緩.這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長,阿魏酰低聚糖進(jìn)一步酶解為小分子的糖類,而導(dǎo)致其產(chǎn)量下降,后來隨著時(shí)間進(jìn)一步延長,酶解效率達(dá)到極限,阿魏酰低聚糖含量基本達(dá)到平衡.通過單因素實(shí)驗(yàn)我們得到,制備阿魏酰低聚糖的最佳時(shí)間為反應(yīng)36 h.

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)阿魏酰低聚糖濃度的影響Fig.1 Effect of reaction time on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.2 木聚糖酶濃度對(duì)阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響

木聚糖酶濃度對(duì)阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖2.由圖2可以看出,隨著木聚糖酶質(zhì)量濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量也在逐漸增加,當(dāng)酶質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/L的時(shí)候,阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量便不再隨著酶質(zhì)量濃度的增加而增加.這是因?yàn)殡S著木聚糖酶酶量的增加,更多的半纖維素降解,阿魏酰低聚糖產(chǎn)量增加,木聚糖酶酶量繼續(xù)增加,酶解反應(yīng)達(dá)到平衡,阿魏酰低聚糖含量不再增加.通過單因素實(shí)驗(yàn),我們得到制備阿魏酰低聚糖的最佳木聚糖酶質(zhì)量濃度為6 g/L.

圖2 木聚糖酶濃度對(duì)阿魏酰低聚糖質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of xylanase concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.3 纖維素酶濃度對(duì)阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響

纖維素酶濃度對(duì)阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響如圖3.由圖3可以看出,隨著纖維素酶濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量在逐漸增加,當(dāng)酶質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/L時(shí),阿魏酰低聚糖產(chǎn)量達(dá)到最大值,后隨著纖維素酶濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量幾乎不變.這是因?yàn)?剛開始隨著纖維素酶濃度的增加,大量的不溶性膳食纖維降解為可溶性膳食纖維,木聚糖酶能夠更好地作用于半纖維素,因此阿魏酰低聚糖的含量增加,后隨著纖維素酶濃度的增加,纖維素酶降解細(xì)胞壁能力達(dá)到極限,阿魏酰低聚糖含量基本不變.由單因素實(shí)驗(yàn)得到制備阿魏酰低聚糖的最佳纖維素酶質(zhì)量濃度為8 g/L.

圖3 纖維素酶濃度對(duì)阿魏酰低聚糖濃度的影響Fig.3 Effect of cellulose concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.4 底物濃度對(duì)阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響

底物濃度對(duì)阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響如圖4,由圖4可以看出,在其他條件一定的情況下,隨著底物濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量在逐漸增加,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到133 g/L的時(shí)候,阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量達(dá)到最大值,后隨著底物濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量下降,這是因?yàn)榱弦罕忍?混合液太過粘稠,酶不能夠很好地與底物接觸,從而導(dǎo)致阿魏酰低聚糖的產(chǎn)量下降.由單因素實(shí)驗(yàn)得到制備阿魏酰低聚糖的最佳底物質(zhì)量濃度為133 g/L.

圖4 底物濃度對(duì)阿魏酰低聚糖濃度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.2 玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),探索利用玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖的最佳條件,結(jié)果如表2.

表2 玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Result of orthogonal test in preparation of feruloyl oligosaccharides from maize bran

運(yùn)用極差對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到結(jié)果:RB＞RA＞RC＞RD,極差R的值越大,說明該因素的效應(yīng)越大,從正交試驗(yàn)可以得到制備阿魏酰低聚糖的主次因素依次是:底物濃度＞反應(yīng)時(shí)間＞木聚糖酶濃度＞纖維素酶濃度.最佳因素水平為A3B3C1D2,考慮到實(shí)際情況,反應(yīng)時(shí)間太長,不利于工業(yè)化生產(chǎn),因此反應(yīng)時(shí)間選擇36 h,即制備玉米麩皮阿魏酰低聚糖的最佳反應(yīng)條件:底物質(zhì)量濃度為165 g/L,木聚糖酶質(zhì)量濃度6 g/L,纖維素酶質(zhì)量濃度8 g/L,反應(yīng)時(shí)間36 h,pH值為5.0,溫度60℃,得到的阿魏酰低聚糖濃度為2.127 mmol/L.

3 結(jié) 論

1)將玉米麩皮進(jìn)行高壓處理,20 h的攪拌處理可以使玉米麩皮充分溶脹,后經(jīng)酶解得到玉米麩皮不溶性膳食纖維,克服了玉米麩皮表面細(xì)胞壁堅(jiān)硬,酶解反應(yīng)效率低的缺陷.

2)利用纖維素酶輔助木聚糖酶反應(yīng)制備阿魏酰低聚糖,由于玉米麩皮表面存在大量的纖維素、半纖維素,這嚴(yán)重影響木聚糖酶酶解效率,采用纖維素酶水解其中的纖維素,使得木聚糖酶能夠更好地作用于玉米麩皮細(xì)胞壁多糖.

3)利用纖維素酶輔助木聚糖酶酶解玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖,克服了傳統(tǒng)的利用酸解,有機(jī)溶劑提取而造成的污染,也克服了傳統(tǒng)的單一酶解玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖效率低的缺點(diǎn).

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