西安市第四醫(yī)院呼吸科(西安 710004)劉 蕊 李志奎

流感病毒是一種引起急性呼吸道傳染性疾病的病毒。按照NP和M1蛋白的抗原性可將流感病毒分為甲、乙、丙 3型。根據(jù) HA和 NA抗原性不同,甲型流感病毒又分為不同的亞型。目前用于人群的流感疫苗主要針對 HA和NA抗原,能在兒童和成人中產(chǎn)生有效保護[1]。病毒樣顆粒(Virus-like particle,VLP)在形態(tài)和結構上類似于病毒,但不含病毒基因組。它一般具有天然的自我裝配能力,可包裹核酸或其他小分子,可作為基因或藥物的裝載工具。VLP目前主要用作基因載體,既能將自身作為病毒疫苗,也能作為疫苗遞送工具[2]。

本實驗構建了以 HBC為載體的 M2基因胞外區(qū)(M2e)通用疫苗桿粒,利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng),進行了初步的蛋白表達。為制備流感通用疫苗奠定了基礎。

材料與方法

1 實驗材料 HBC基因序列由大連 TaKaRa公司合成,昆蟲細胞桿狀病毒載體質粒pFastHT A、脂質體cellinfectin reagent、sf900Ⅲ昆蟲細胞培養(yǎng)基和 sf9昆蟲細胞購自美國 invotrgon公司,感受態(tài)細胞 DH5a和 DH10Bac由軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所保存,限制性內(nèi)切酶 Kpn I、Nco I、T4連接酶及 DNA/RNA Minibest extraction kit ver 3.0購自大連Takara公司,低熔點瓊脂糖粉購自德國 Sigma公司。

2 實驗方法

2.1 基因合成 兩條由 Takara公司合成的基因序列來源分別為NCBI Genbank所報道。HBC序列號為 AM184126,gene1814～2458,全長 644bp,經(jīng)測序正確。

2.2 引物設計 根據(jù) Takara公司合成的基因序列 設 計 一 對 引 物。 上 游 引 物: 5’-atggatccatgagtcttctaaccgaggtcgaaacgcctatcagaaacgaat gggggtgcagatgcaacgattcaagtgatcaactttttcacctctgcct-

3’,下游引物:5’-cgaagcttgcgtttagcagt-3’。引入 BamHⅠ ,HindⅢ酶切位點。

2.3 PCR和擴增產(chǎn)物回收 按說明配制 PCR反應體系:10倍 PCR緩沖液 2.5μ l,10mmol/L dNTPs 1 μ l,50 pmol/L上游引物 1μ l,50 pmol/L下游引物 1 μ l,Taq DNA聚合酶 0.3μ l,超純水 17.2 μ l。瞬時離心后,94℃預變性 5 min;94℃ 45 s,58℃ 45 s,72℃ 90 s,25個循環(huán);72℃延伸 10 min,4℃運行 10 min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,回收目的片斷。

2.4 構建含 sf9昆蟲細胞表達載體的質粒與鑒定 回收的目的片斷與載體 pFastBac HTA質粒DNA分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ ,HindⅢ雙酶切回收后,在 T4連接酶的作用下將目的基因片段與載體片段按 3∶1物質的量比例進行連接,連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌 DH5a,挑取經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選的單克隆菌落擴增培養(yǎng),提取重組質粒DNA,經(jīng)雙酶切,PCR方法鑒定正確的重組質粒送至上海英駿生物技術有限公司測序鑒定。將鑒定結果提交 Genbank進行 Blast比對。

2.5 同源重組 將重組質粒用 CaCl2轉化方法轉化 DH10Bac,挑取經(jīng) Kana、Tet、Gen和藍白斑篩選的單克隆菌落擴增培養(yǎng)。堿裂解法提桿粒,用 M13-M4、M13-RV引物進行 PCR擴增,以進一步鑒定陽性重組體。

2.6 轉染sf9昆蟲細胞 轉染前在6孔平板上每一孔內(nèi)加入 9× 105sf9昆蟲細胞,27℃放置 1h,將 1 μ g桿粒和 6 μ l轉染試劑分別稀釋至 100μ lsf900Ⅲ昆蟲細胞培養(yǎng)基中,兩者混勻,室溫孵育 15～ 45 min后覆蓋于細胞上,27℃放置 5h,棄去轉染混合物加入 sf900Ⅲ昆蟲細胞培養(yǎng)基,27℃孵育 72 h。收獲病毒,DNA/RNA minibest extraction kit提取病毒 DNA,PCR分析細胞培養(yǎng)物的病毒顆粒,鑒別重組體,證明插入序列的大小。

2.7 空斑試驗 在6孔平板上每一孔內(nèi)加入1×106sf9昆蟲細胞,27℃放置1 h,將病毒上清作 8 Log系列稀釋(10-1～ 10-8)。將孔內(nèi)上清棄去后,依次加入1 ml對照培養(yǎng)基及各病毒稀釋液,27℃放置 1 h,按 3∶1比例混勻sf900昆蟲空斑培養(yǎng)基(1.3×)與4%瓊脂凝膠,于 40℃水浴,分別加 2 ml于各孔中,27℃孵育 4～ l0d,每天觀察平板直至空斑計數(shù)連續(xù)兩天不變。

2.8 重組病毒表達 將轉染后的細胞用3%多聚甲醛固定 20 min;PBS洗 2次;0.2%TritonX-100打孔5 min;PBS洗 1次;10%FBS封閉 20 min;PBS洗 3次;3%BSA稀釋帶有 HiS-tag的小鼠單克隆抗體,室溫孵育 1 h;PBS洗 3次;1%Triton X-100+3%BSA打孔 5 min;PBS洗 2次;3%BSA稀釋帶有 FITC熒光素的羊抗鼠二抗,室溫孵育 1 h;PBS洗 3次;80%甘油封片,熒光顯微鏡觀察;收集感染后的細胞加入 5×SDS凝膠上樣緩沖液,100℃煮沸 5 min,室溫下離心 1 min,取 10 μ l進行 SDS-PAGE(聚合膠 5%,分離膠 15%),考馬斯亮藍染色。

2.9 電鏡觀察 收集感染重組桿狀病毒 72 h的sf9昆蟲細胞各107,加入約 5倍體積昆蟲細胞裂解液,輔以簡短超聲裂解,3000 r/min離心 30 min,去除沉渣,取上清,30000 r/min超速離心 3 h,吸出管底液體,取10 μ l滴于碳膜包被的銅網(wǎng)上,室溫放置5 min,吸取多余液體,再經(jīng)磷鎢酸負染,在透射電鏡下觀察重組病毒VLP在昆蟲細胞中的存在狀況。

結 果

1 擴增 M2e-HBC 經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,獲得大小約 700bp的目的基因片段,與預計片段大小相符(見圖1),表明獲得所需的目的片段。

2 含昆蟲細胞表達載體的質粒鑒定 提取質粒DNA,凝膠電泳顯示,M2e-HBC-pFas+BacHTA大小為 5.5kb,與預計片段大小相符。用雙酶切鑒定,M2e-HBC-pFas+Bac HTA電泳為兩條帶,分別為 700bp和4.8 kb。將酶切鑒定為陽性的質粒DNA進行PCR,電泳出現(xiàn)大小約700bp的目的基因片段(見圖2)。測序結果提交Genbank進行Blast比對,目的基因片段序列與 M2e-HBC完全一致。

圖1 PCR擴增 M2e-HBC基因 1示 M2e-HBG基因片斷;M示標準分子量 DL2000

圖2 M2e-HBG-pFas+Bac HYA質粒鑒定結果 M 1示DN A標準 (DL15000);1示 M2e-HBC-pFas+BacHTA質粒電三療結果;2示 M2e-HBC-pFas+BacHTA酶切結果;3示 M2e-HBC-pFas+BacHTA鑒定結果;M2示 DN A標準 CDL2000

3 同源重組鑒定 同源重組后,堿裂解法提取桿粒,獲得大小約 135 kb的基因組。 M2e-HBC轉位pFastBac HTA的桿粒 PCR,經(jīng) 0.7%瓊脂糖電泳鑒定,可見大小約為 3100 bp的基因片段(見圖 3)。

4 轉染 sf9昆蟲細胞結果 轉染前sf9昆蟲細胞形態(tài)正常,轉染后sf9昆蟲細胞變大、變圓,或形態(tài)不規(guī)則,胞膜溶解,細胞破碎。

5 空斑試驗結果 肉眼觀察,重組病毒產(chǎn)生很淡的牛奶樣空斑,經(jīng)計算,原始母株效價約為 3×106pfu/ml。

6 蛋白表達結果 收集感染的sf9昆蟲細胞進行SDS-PAGE,結果顯示在26000有一條帶,而在對照則無此條帶(見圖 4),表明M2e-HBC重組病毒可表達出蛋白,約占細胞總蛋白的l0%。

圖3 桿粒 M2e-HBG-PCR鑒定 1示 M2e-HBC桿粒 PCR結果;M示 DNA標準 (CDL15000)

圖4 12%SDS-PAGE檢測 M2e-HBC蛋白 sfs細胞的表達 1示 sfs細胞表達 M2e-HBC蛋白;2示空白對照(sf9細胞);M示低分子量標準量蛋白

供體載體 pFas+Bac HTA N端帶有6×His-tag,因此轉染后的細胞經(jīng)熒光抗體染色法染色后,置于熒光顯微鏡下觀察,可見轉染成功,表達 His-tag蛋白的細胞發(fā)出強烈的綠色熒光;而未表達 His-tag蛋白的細胞則較為暗淡 ,為非特異性熒光(見圖 5)。

7 電鏡觀察 經(jīng)透射電鏡觀察表明細胞內(nèi)有球形空心病毒樣顆粒形成,大小約 50 nm(見圖 6),表明M2e-HBC VLP是由重組桿狀病毒感染后昆蟲細胞合成的。

圖5 熒光顯微鏡下檢測到的表達帶有 His-tag蛋白的細胞

圖6 電鏡下的 M2e-HBC病毒樣顆粒(箭頭示)(×65 000)

討 論

自從1933年第一株流感病毒被分離以來,所有報道的人類M2e序列經(jīng)比對后證實高度保守,只有兩個位置有氨基酸的替換。通過連接M2e到合適的載體上,證實了其可呈遞它的免疫原性,并且發(fā)現(xiàn)抗體反應有效,能夠完全保護小鼠逃避潛在致死性流感病毒感染[2～3]。因此,目前關于甲型流感病毒 M2e蛋白疫苗的研究成為一個熱點。據(jù)報道,英國和比利時的公司已經(jīng)在進行 M2e-HBC融合蛋白疫苗的開發(fā),但他們是將M2e-HBC蛋白表達在原核細胞內(nèi)。本實驗采用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng),由于是真核表達系統(tǒng),表達的重組蛋白具有完整的生物學功能,結構及功能上接近天然蛋白且表達水平高,所以被選擇替代大腸桿菌系統(tǒng),以期得到更加優(yōu)化的重組目的蛋白。天然分離或人工合成的具有免疫原性的表位(M2e)可以通過基因工程方法在機體得到表達,但該方法也具有一定弊端:①病原體抗原和人工表位相對分子質量常常較小,免疫原性低,難以產(chǎn)生足夠的免疫反應;②外源肽段在機體免疫系統(tǒng)內(nèi)僅能獲得弱的呈遞性;③小分子肽段在體內(nèi)容易降解,故免疫力持續(xù)時間短;④單一表位往往在人群中的覆蓋率低,難以產(chǎn)生有應用價值的廣泛的保護性。所以,在當今的疫苗研制工作中以添加佐劑和使用結構復雜病毒蛋白作為表位免疫原性的放大載體就成為工作中的一個熱點。重組體蛋白是否具有免疫原性及免疫原性的高低主要依賴重組體病毒是否在細胞中自我包裝成VLP。在本實驗中,HBC融合 M2e后,通過電鏡觀察說明仍可自動裝配出VLP,從而為增強 M2e的免疫原性提供了依據(jù)。進一步的試驗純化出蛋白后,通過敏感動物模型,可以確定VLP-M2e通用疫苗最佳免疫策略,包括免疫途徑、佐劑、免疫劑量及次數(shù)等。將人禽流感病毒 HA、NA、NP等基因片段的保護序列分別與M2e融合,建立高表達VLP-M2e-X的昆蟲桿狀病毒系統(tǒng),篩選出具有良好保護效果的通用疫苗 VLPM2e-X等都是今后試驗的目標。制備流感通用疫苗甚至人禽流感通用疫苗具有良好的前景,可以依靠多種方法、途徑來實現(xiàn)。

[1]Nicholson KG,Wood JM,Zambon M.Influenza[J].Lancet,2003,362(9397):1733-1745.

[2]王惠明,吳玉章.以病毒樣顆粒為平臺的分子載體和疫苗設計 [J].免疫學雜志 ,2006,22(1):110-113.

[3]HuleattJW,NakaarV,DesaiP,etal. Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccinecandidate comprising a recombinantfusion protein 1inking influenza M2e to the TLR5ligand nagellin.Vaccine,2008,26(2):201-214.