南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院麻醉科(深圳 518028)

黃穗萍 黃曉雷 李元濤▲ 曹 君 孟 馨 蘇嬌玲 胡 薇

研究表明[1]咪達(dá)唑侖可濃度依賴性地抑制孕和未孕大鼠子宮平滑肌收縮,但其抑制子宮收縮的作用機(jī)制仍不清楚。子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+是肌肉興奮-收縮偶聯(lián)的活化劑,與肌動(dòng)蛋白、肌漿蛋白的結(jié)合引起子宮收縮[2,3]。而咪達(dá)唑侖抑制子宮平滑肌收縮是否與影響子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)外游離 Ca2+移動(dòng)有關(guān)呢?因此本研究擬采用 Fluo-3AM鈣熒光指示劑測鈣技術(shù),觀察不同濃度的咪達(dá)唑侖對足月產(chǎn)婦子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)外 Ca2+跨膜內(nèi)流和肌漿網(wǎng) Ca2+釋放功能的影響,探討其對子宮收縮影響的可能機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),取孕足月健康產(chǎn)婦子宮平滑肌組織,約 0.5cm×0.5cm×1.5cm大小;實(shí)驗(yàn)用 DMEM購于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;胎牛血清購于上海肯強(qiáng)貿(mào)易有限公司;氯化鉀購于湖北清大康迪藥業(yè)有限公司生產(chǎn);0.2%Ⅱ型膠原酶、0.2%胰蛋白酶及咖啡因購于美國 Sigma公司;酯化形式的Fluo-3AM購于美國Molecular Prob公司;細(xì)胞觀察顯微鏡采用日本 Olympus IX 70顯微鏡;鈣熒光強(qiáng)度測定采用德國 Zeiss公司 LSM-510激光共聚焦顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法 將子宮平滑肌組織于無菌條件下快速送實(shí)驗(yàn)室,用75%酒精沖洗兩遍,再用 PBS沖洗 3遍后剪碎和洗滌,加入適量的 0.2%Ⅱ型膠原酶(DM EM+Ⅱ型膠原酶),37℃水浴震蕩消化 4～ 5h,加入完全 DMEM培養(yǎng)液(80%DMEM+20%胎牛血清)DMEM培養(yǎng)液(DMEM+10%胎牛血清+青霉素100IU/ml+鏈霉素 100 μ g/ml)終止消化,用吸管反復(fù)輕輕吹打、過濾、離心、去上清液,將離心所得細(xì)胞加入適量完全 DMEM培養(yǎng)液充分混勻,接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶中,置 37℃,100%飽和濕度和 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)30h后第1次換液,以后每兩天換液1次,并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。細(xì)胞共計(jì)生長 10d后用0.2%胰蛋白酶消化后平均分別置于 12孔板中。

第一部分 將子宮平滑肌細(xì)胞在室溫下用100mmol/L酯化形式的 Fluo-3AM染色 60min后,用Hank液浸洗去細(xì)胞外殘余熒光染色劑,在相差顯微鏡下挑選活性良好的子宮平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。40個(gè)孔板中活性良好的子宮平滑肌細(xì)胞隨機(jī)等分為 4組(n=10):對照組、低濃度咪達(dá)唑侖組(M1組)、中濃度咪達(dá)唑侖組(M2組)、高濃度咪達(dá)唑侖組(M3組),用 LSM-510激光共聚焦顯微鏡測定反映游離 Ca2+濃度的細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長 488nm,發(fā)射波長 505nm),測定鈣熒光強(qiáng)度的基礎(chǔ)值后,分別給予 Hank’s液、終濃度 為 1 μ mol/L、 3 μ mol/L、 15 μ mol/L 咪 達(dá) 唑 侖處 理20min后再測定鈣熒光強(qiáng)度,然后加入氯化鉀(批號(hào):H42020421),同時(shí)每隔 10s掃描一幅記錄鈣熒光強(qiáng)度峰值。每個(gè)孔板在激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)選定10個(gè)子宮平滑肌細(xì)胞,利用圖形分析軟件分析細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度,記錄峰值后取平均值。

第二部分以咖啡因(終濃度 20mmol/L)代替氯化鉀,其余同第一部分。

結(jié) 果

1 子宮平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及熒光染色子宮平滑肌細(xì)胞圖 見圖 1～3。

2 游離Ca2+濃度測定結(jié)果 見表1～ 2。第一部分與基礎(chǔ)值比較:各組加入咪達(dá)唑侖后鈣熒光強(qiáng)度無顯著性差異(P＞0.05),但加入氯化鉀后鈣熒光強(qiáng)度升高(P＜0.01);M1組與對照組加入氯化鉀后鈣熒光強(qiáng)度無顯著性差異(P＞0.05),M2組與 M3組加入氯化鉀后鈣熒光強(qiáng)度峰值低于對照組(P＜0.01),且 M3組低于 M2組(P＜0.05)。第二部分與基礎(chǔ)值比較,各組加入咪達(dá)唑侖后鈣熒光強(qiáng)度無顯著性差異(P＞0.05),加入咖啡因后鈣熒光強(qiáng)度升高(P＜0.01);加入咖啡因后各組鈣熒光強(qiáng)度無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 子宮平滑肌細(xì)胞 (×40)

圖2 熒光染色子宮平滑肌細(xì)胞(×40)

圖3 圖形分析軟件所示結(jié)果

表1 咪達(dá)唑侖對氯化鉀誘發(fā)子宮平滑肌細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度峰值變化的影響(n=10,±s)

表1 咪達(dá)唑侖對氯化鉀誘發(fā)子宮平滑肌細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度峰值變化的影響(n=10,±s)

※注:與基礎(chǔ)值比較,* P＜0.01;與對照組比較,△ P＜0.01;與 M1組比較,#P＜0.01;與 M2組比較,※ P＜0.01

組 別 基礎(chǔ)值 預(yù)處理后 氯化鉀誘發(fā)對照 組 80.11± 8.02 81.56± 8.10 180.31± 13.87*M1組 80.45± 7.98 81.78± 9.21 159.75± 12.39* △M2組 81.49± 9.01 80.95± 9.33 140.71± 12.31* △#M3組 79.67± 8.27 82.38± 9.61 121.75± 11.03* △#

表2 咪達(dá)唑侖對咖啡因誘發(fā)子宮平滑肌細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度峰值變化的影響(n=10,±s)

表2 咪達(dá)唑侖對咖啡因誘發(fā)子宮平滑肌細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度峰值變化的影響(n=10,±s)

注:與基礎(chǔ)值比較,* P＜0.01

組 別 基礎(chǔ)值 預(yù)處理后 咖啡因誘發(fā)對照 組 81.75± 7.94 81.41± 5.16 121.64± 10.33*K1組 79.58± 9.24 82.07± 9.23 122.64± 12.07*K2組 83.35± 7.90 82.84± 6.17 121.54± 11.71*K3組 83.11± 7.997 82.35± 6.16 120.95± 11.32*

討 論

細(xì)胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)作為第二信使,對細(xì)胞、組織、器官及整個(gè)生命系統(tǒng)的功能具有非常重要的影響。 [Ca2+]i濃度的變化,是諸多生理和病理變化的起動(dòng)和發(fā)展的重要中介因素。子宮收縮的動(dòng)因來自內(nèi)源性催產(chǎn)素和前列腺素的釋放。催產(chǎn)素可促進(jìn)鈣離子向肌細(xì)胞內(nèi)移動(dòng),前列腺素是鈣離子的載體,其與鈣離子形成復(fù)合體并將其帶入肌細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子是肌肉興奮-收縮偶聯(lián)的活化劑,與肌動(dòng)蛋白、肌漿蛋白的結(jié)合引起子宮收縮與縮復(fù),使肌纖維間子宮血管受壓而迂曲閉塞,加之內(nèi)源性前列腺素作用下血小板的聚集、凝固加強(qiáng),參與并引發(fā)凝血和血栓形成,堵塞胎盤剝離面處子宮血管,從而完成分娩的自然止血?？梢娝杏绊懽訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)外鈣離子移動(dòng)的因素都有可能干擾子宮收縮,導(dǎo)致產(chǎn)后出血。 Gursoy等[4]發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥抑制妊娠子宮平滑肌收縮性與鈣離子活動(dòng)有關(guān)。 Tsujiguchi等[5]發(fā)現(xiàn)丙泊酚抑制縮宮素誘發(fā)的孕鼠子宮平滑肌收縮,其可能機(jī)制是丙泊酚抑制孕鼠子宮平滑肌細(xì)胞膜上的鈣通道導(dǎo)致鈣內(nèi)流減少。Yamakage等[6]發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖通過抑制細(xì)胞膜上的鈣通道,降低細(xì)胞內(nèi)鈣引起犬氣道平滑肌松弛。因此我們推測咪達(dá)唑侖可能影響子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)、外 Ca2+移動(dòng)而影響子宮收縮。

咪達(dá)唑侖是一種具有較強(qiáng)鎮(zhèn)靜、順行性遺忘作用的靜脈全麻藥,對呼吸循環(huán)系統(tǒng)影響較輕,廣泛應(yīng)用于臨床麻醉,其臨床誘導(dǎo)峰濃度為3 μmol/L。參照李繼昌等[7]研究咪達(dá)唑侖對大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響,本研究選擇 1、3、15 μ mol/L 3種濃度的咪達(dá)唑侖預(yù)處理子宮平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Fluo-3AM是一種高度特異性的 Ca2+熒光探針,進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)水解去掉乙酸甲酯(AM)成為 Fluo-3。Fluo-3在無 Ca2+存在時(shí)基本不發(fā)熒光.而與細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+結(jié)合后.其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng).因此細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的改變可靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+濃度的變化。細(xì)胞內(nèi)有游離鈣和結(jié)合鈣兩種 Ca2+存在,游離鈣的濃度 [Ca2+]i受 Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)鈣庫的 Ca2+動(dòng)員影響。理論上高濃度的氯化鉀可促使細(xì)胞膜去極化,細(xì)胞膜上電壓依賴性鈣通道開放,鈣離子跨膜內(nèi)流,使 [Ca2+]i升高而產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)[8]。而咖啡因?yàn)閯?dòng)員 Ryanodine型鈣釋放而使 [Ca2+]i升高[9]。本研究參照李元濤等[10]實(shí)驗(yàn),選擇 40mmol/L的氯化鉀和20mmol/L的咖啡因誘發(fā)子宮平滑肌細(xì)胞 [Ca2+]i升高,觀察不同濃度的咪達(dá)唑侖對其鈣離子移動(dòng)變化的影響。

本研究第一部分各組加入 40mmol/L氯化鉀后,細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度迅速升高,提示氯化鉀可引起子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。氯化鉀引起的鈣離子濃度升高與細(xì)胞內(nèi)鈣釋放及細(xì)胞膜上的受體無關(guān),主要源于細(xì)胞外高濃度的鉀離子對細(xì)胞膜外向鉀電流的抑制導(dǎo)致細(xì)胞膜的去極化,從而激活了 L-型電壓依賴性鈣通道(L-VDCC),繼而引起細(xì)胞外 Ca2+的跨膜內(nèi)流,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度升高[11]。 K1組結(jié)果顯示,預(yù)先應(yīng)用 30 μ mol/L的咪達(dá)唑侖后,氯化鉀引起的Ca2+濃度升高幅度無明顯變化,但 K2、K3組結(jié)果顯示,預(yù)先應(yīng)用 100 μ mol/L、300 μ mol/L的咪達(dá)唑侖后 ,氯化鉀引起的 Ca2+濃度升高幅度明顯變小,且 K3組明顯小于K2組。由于L-VDCC是氯化鉀引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高的主要途徑,由此推測,低濃度咪達(dá)唑侖對子宮平滑肌細(xì)胞膜上的 L-VDCC無抑制作用,而中、高濃度咪達(dá)唑侖可能對子宮平滑肌細(xì)胞膜上的 L-VDCC存在一定程度的抑制作用,其抑制作用呈濃度依賴性。

第二部分各組加入 20mmol/L咖啡因后,細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度升高,提示咖啡因可引起子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高,咖啡因是細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放劑,可引起肌漿網(wǎng)釋放 Ca2+,各組預(yù)先應(yīng)用咪達(dá)唑侖后,咖啡因引起的Ca2+濃度升高幅度無明顯變化,由此推測,咪達(dá)唑侖對子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng) Ca2+釋放功能無明顯影響。

我們推測咪達(dá)唑侖可能通過抑制子宮平滑肌細(xì)胞膜上 L-VDCC,減少 Ca2+內(nèi)流,降低細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+濃度,影響子宮平滑肌細(xì)胞收縮。而咪達(dá)唑侖對子宮平滑肌細(xì)胞膜上的受體門控通道(ROC)、鈣庫控制通道(SOC)等 Ca2+通道的影響有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,高濃度咪達(dá)唑侖可明顯抑制人子宮平滑肌收縮,可能會(huì)引起宮縮乏力,導(dǎo)致產(chǎn)后出血,因此產(chǎn)科麻醉避免使用高濃度的咪達(dá)唑侖,尤其是存在有宮縮乏力高危因素的產(chǎn)婦。

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