曹學(xué)仁，詹浩宇，周益林，段霞瑜中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 0093;北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司，北京 00055

小麥矮腥黑穗病菌Tilletia controversaKühn(TCK)是一種重要的世界性檢疫病原菌，由其引起的小麥矮腥黑穗病是麥類(lèi)黑穗病中危害最大、防治最難的檢疫性病害之一。目前，該病害已在歐洲、美洲、亞洲及非洲等30多個(gè)國(guó)家發(fā)生，美國(guó)西北部的小麥染病尤為普遍(崔良剛和程義美，2003)。TCK至今仍被我國(guó)列為嚴(yán)禁入境的檢疫性真菌，它具有傳入和定殖的風(fēng)險(xiǎn)，因此必須采取嚴(yán)格的檢驗(yàn)檢疫措施，防止TCK隨進(jìn)口小麥流入我國(guó)(陳克等，2002;周益林等，2007)。近年來(lái)，我國(guó)口岸檢疫機(jī)構(gòu)曾多次在由美國(guó)、加拿大及歐盟進(jìn)口的小麥中截獲TCK冬孢子。但小麥網(wǎng)腥黑穗病菌T.caries(DC)Tul(TCT)、TCK及小麥光腥黑穗病菌T.foetia(Wallr.)Liro(TFL)的冬孢子形態(tài)非常相似，這給口岸檢疫工作帶來(lái)了很大的障礙。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者主要從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)檢測(cè)等方面進(jìn)行了大量有益的研究和探索工作(董薇等，2007;林授鍇等，2008;年四季等，2009)。但如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出TCK，一直是廣大學(xué)者和口岸工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。

電子鼻(electronic nose)是一種由具有選擇性的化學(xué)傳感器陣列和適當(dāng)?shù)哪Ｊ阶R(shí)別系統(tǒng)組成，能識(shí)別簡(jiǎn)單或復(fù)雜氣味的儀器。近年來(lái)，電子鼻技術(shù)在谷物霉變、毒素及活性的檢測(cè)中得到了探索與利用。1997年，Jonssonet al.利用電子鼻結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別技術(shù)，對(duì)不同氣味的燕麥、黑麥和大麥以及含有不同麥角固醇和菌落總數(shù)的小麥進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠準(zhǔn)確識(shí)別不同霉變程度的燕麥，也可以預(yù)測(cè)霉變大麥和新鮮大麥、霉變黑麥和新鮮黑麥混合物中霉變谷物的百分比。Olssonet al.(2002)利用電子鼻對(duì)大麥中的真菌毒素OA和DON進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，電子鼻既能區(qū)分赭曲霉素A含量大于和小于5 μg·kg-1的大麥，也能預(yù)測(cè)谷物中DON的含量。鄒小波和趙杰文(2004)利用電子鼻快速、準(zhǔn)確地分析谷物散發(fā)的氣味，從而判定谷物是否霉變。偉利國(guó)等(2010)利用電子鼻技術(shù)對(duì)小麥的活性進(jìn)行了檢測(cè)。由于小麥?zhǔn)躎CK危害后，植株矮化，分蘗增多，籽粒變?yōu)榫`，具有魚(yú)腥味，這就為利用電子鼻技術(shù)來(lái)檢測(cè)小麥中的TCK提供了可能。因此，本研究利用電子鼻對(duì)含有不同TCK冬孢子數(shù)的小麥進(jìn)行檢測(cè)分析，以期探索出一種能夠快速檢測(cè)TCK的新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)處理

供試TCK來(lái)自于美國(guó)農(nóng)業(yè)部小谷物種質(zhì)資源研究所;TFL由本實(shí)驗(yàn)室提供。

稱(chēng)取50 g小麥種子放入100 mL的三角瓶中，利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下用蒸餾水將TCK的冬孢子濃度配成108個(gè)·mL-1并以梯度稀釋后，加入三角瓶中，每個(gè)三角瓶中加冬孢子懸浮液10 μL，使每50 g小麥種子中的冬孢子含量分別為105、104、103、102、101及 100個(gè)。TFL 冬孢子懸浮液的配制以及每50 g小麥種子中的冬孢子含量與TCK處理一致。兩者均以清水為對(duì)照，然后用雙層保鮮膜封口，每個(gè)處理重復(fù)4次。試驗(yàn)開(kāi)始1 h前，將處理好的三角瓶置于25℃的培養(yǎng)箱中。

1.2 主要儀器

本研究采用的是PEN3型電子鼻系統(tǒng)(德國(guó)AIRSENSE公司)，由北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司提供。該電子鼻含有10個(gè)不同的金屬氧化物傳感器，組成傳感器陣列。各傳感器的性能描述見(jiàn)表1。

表1 傳感器性能描述Table 1 Descriptions of sensors

1.3 試驗(yàn)方法

采用直接頂空吸氣法，即直接將電子鼻進(jìn)樣針頭插入經(jīng)1.1處理的三角燒瓶中進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件:傳感器自清洗時(shí)間為100 s，傳感器歸零時(shí)間為10 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間為3 s，進(jìn)樣流量為300 mL·min-1，分析采樣時(shí)間為60 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

提取10個(gè)傳感器的特征值，采用主成分分析法(principal component analysis，PCA)和線性判別法(linear discriminant analysis，LDA)作為主要分析方法。

PCA是把多個(gè)指標(biāo)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計(jì)方法，并對(duì)少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)進(jìn)行線性分類(lèi)，PCA分析的結(jié)果僅顯示主要的兩維散點(diǎn)圖。PC1和PC2分別為PCA轉(zhuǎn)換中得到的第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率，貢獻(xiàn)率越大，說(shuō)明該主成分越能較好地反映原來(lái)多指標(biāo)的信息。

LDA分析是模式識(shí)別的經(jīng)典算法，將高維的模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間，以達(dá)到抽取分類(lèi)信息和壓縮特征空間維數(shù)的效果，投影后保證模式樣本在新的子空間有最大的類(lèi)間距離和最小的類(lèi)內(nèi)距離，即模式在該空間中有最佳的可分離性。與PCA分析相比，LDA更側(cè)重于對(duì)不同類(lèi)數(shù)據(jù)之間的差別進(jìn)行建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCK的電子鼻檢測(cè)

10個(gè)傳感器對(duì)健康小麥與添加TCK冬孢子后小麥揮發(fā)物的響應(yīng)曲線見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，不同傳感器對(duì)健康小麥揮發(fā)物的反應(yīng)不同，其中以2號(hào)傳感器(對(duì)氮氧化合物類(lèi)敏感)的響應(yīng)值較大。與健康小麥相比，加入冬孢子后，傳感器的響應(yīng)值有明顯變化。

圖1 10個(gè)傳感器對(duì)健康小麥(A)及加入TCK后小麥(B)的響應(yīng)曲線Fig.1 Curves of 10 sensors responding to wheat(A)and to wheat with TCK teliopores(B)

2.2 PCA 分析

PCA分析結(jié)果顯示，在CORRELATION相關(guān)性矩陣模式下，第一主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率為84.64%，第二主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率為10.20%，2個(gè)主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率總和為94.84%，大于90%，表明這2個(gè)主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征(圖2)。同時(shí)，從圖2可以看出，利用PCA分析，可以將含TCK冬孢子的小麥與不含TCK冬孢子的小麥(CK)很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)，且對(duì)含有不同孢子數(shù)的小麥也有一定的區(qū)分能力，其中，當(dāng)每50 g小麥中的冬孢子數(shù)超過(guò)104時(shí)，可明顯與冬孢子數(shù)為100、101、102及103的處理區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖2 含不同冬孢子數(shù)小麥的PCA分析圖Fig.2 PCA score plot of wheat grains containing different numbers of TCK teliopores

2.3 LDA 分析

從LDA分析結(jié)果(圖3)可以看出，線性判別函數(shù)LD1和LD2的貢獻(xiàn)率分別為65.78%和19.88%，兩者總貢獻(xiàn)率達(dá)85.66%。該分析結(jié)果表明，利用電子鼻可以將不含TCK冬孢子的小麥(CK)和含有不同冬孢子數(shù)的小麥區(qū)分開(kāi)來(lái)，并且呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。同時(shí)還可將50 g小麥中含100、101、102個(gè)冬孢子的處理與冬孢子數(shù)大于103的處理區(qū)分開(kāi)來(lái)，也能將100、101、102個(gè)冬孢子的處理彼此區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此與PCA分析結(jié)果相比，LDA分析對(duì)不同冬孢子數(shù)處理間的區(qū)分效果更好，且線性關(guān)系明顯。

圖3 含不同冬孢子數(shù)小麥的LDA分析Fig.3 LDA score plot of wheat grains containing different numbers of TCK teliopores

2.4 電子鼻檢測(cè)區(qū)分TCK和TFL

利用電子鼻分別對(duì)含有TCK和TFL的小麥進(jìn)行測(cè)定，并利用PCA和LDA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從PCA分析結(jié)果(圖4)可以看出，第一主成分和第二主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率總和為96.99%，且不同TCK冬孢子數(shù)的處理與不同TFL冬孢子數(shù)的處理各自分布在一起，兩者之間可以很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)。但是，利用LDA分析，兩者在圖上的分布區(qū)域出現(xiàn)重疊(結(jié)果未顯示)，表明該分析方法不能將 TCK與TFL區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖4 含不同TCK和TFL冬孢子數(shù)小麥的PCA分析圖Fig.4 PCA score plot of wheat grains containing different numbers of TCK and TFL teliopores

3 討論

“電子鼻”的概念最早是由英國(guó)Warwick大學(xué)的Persand和Dodd教授于1982年模仿哺乳動(dòng)物嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)幾種有機(jī)揮發(fā)氣體進(jìn)行類(lèi)別分析時(shí)提出來(lái)的。隨著材料科學(xué)、制造工藝、計(jì)算機(jī)與應(yīng)用數(shù)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的進(jìn)步，電子鼻研究迅速發(fā)展，在食品、環(huán)境監(jiān)控、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)與公共安全等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用(金翠云等，2010)。本研究利用電子鼻技術(shù)對(duì)含有不同TCK冬孢子數(shù)的小麥種子進(jìn)行了測(cè)定，采用PCA和LDA法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，利用電子鼻可以將不含TCK的小麥和含有TCK的小麥區(qū)分開(kāi)來(lái)，且對(duì)含不同冬孢子數(shù)的小麥也有一定的區(qū)分效果，特別是TCK冬孢子含量較大時(shí)。與其他檢測(cè)方法相比，電子鼻技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定迅速、無(wú)損及結(jié)果客觀等優(yōu)點(diǎn)，因此本研究為探索TCK快速檢測(cè)的新方法提供了參考。

本研究還發(fā)現(xiàn)，利用電子鼻結(jié)合PCA分析，可以很好地將同樣具有魚(yú)腥味的TFL和TCK區(qū)分開(kāi)來(lái)。但是，對(duì)于與TCK在形態(tài)上更相似且具有魚(yú)腥味的TCT，能否利用電子鼻技術(shù)并結(jié)合適當(dāng)?shù)姆治龇椒▍^(qū)分開(kāi)來(lái)，還需要進(jìn)一步研究;另外，不同的小麥品種及小麥的不同陳化程度對(duì)電子鼻的響應(yīng)是否有影響，也需要研究來(lái)證實(shí)。

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