陳曉雯，林 勝，尤民生，楊 廣，王 鋒福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所;農(nóng)業(yè)部亞熱帶農(nóng)業(yè)生物災(zāi)害與治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室;福建省昆蟲生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 5000;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建福州 5001

土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場所，土壤微生物在土壤形成和發(fā)育、土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡、土壤環(huán)境凈化與生物修復(fù)等諸多方面起著重要作用。因此，評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義。轉(zhuǎn)基因作物主要通過植株殘?bào)w、根及根系分泌物、花粉向土壤中釋放Bt殺蟲蛋白(白耀宇等，2005)?，F(xiàn)已有研究證明，Bt毒蛋白進(jìn)入土壤后，與土壤粘粒和腐質(zhì)酸迅速結(jié)合且不易分離，并能抵抗土壤微生物的降解(Tappet al.，1994;Tapp ＆ Stotzky，1995、1998)。

關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落的影響，國內(nèi)外學(xué)者已開展了大量的研究，但目前還未得到統(tǒng)一的結(jié)論。任馨等(2004)采用PCR-DGGE等技術(shù)，通過研究抗蟲水稻秸稈的添加對淹水土壤中可培養(yǎng)厭氧細(xì)菌數(shù)量和細(xì)菌群落組成的影響，發(fā)現(xiàn)Bt水稻釋放的毒蛋白對土壤中可培養(yǎng)的微生物群落無明顯的毒害作用。Liuet al.(2008)通過持續(xù)3年的田間試驗(yàn)，采用DGGE和T-RFLP分子生物學(xué)手段，檢測了轉(zhuǎn)Bt基因及其親本水稻根際細(xì)菌與真菌群落的多樣性，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt基因?qū)ν寥栏H微生物多樣性無顯著影響。但陳敏和應(yīng)文荷(2005)用純培養(yǎng)和ERIC-PCR方法，研究比較了轉(zhuǎn)Bt基因水稻和常規(guī)水稻根際土壤細(xì)菌類群的數(shù)量和組成，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt水稻根際土壤的細(xì)菌生理類群在數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成上均明顯不同于常規(guī)水稻。

本研究應(yīng)用PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)和Biolog技術(shù)，對水稻土壤微生物的遺傳多樣性和碳源代謝功能多樣性進(jìn)行分析，并結(jié)合對土壤微生物種群數(shù)量的測定，探討轉(zhuǎn)基因水稻對水稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的影響，以期為轉(zhuǎn)基因水稻的安全性評價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2010年7～9月在福建省福州市蓋山鎮(zhèn)吳鳳村福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因水稻試驗(yàn)基地進(jìn)行。該試驗(yàn)地土壤基本理化性質(zhì):有機(jī)質(zhì)9.16 g·kg-1、全氮 0.637 g·kg-1、全磷 0.362 g·kg-1、全鉀29.7 g·kg-1、堿解氮 68.3 mg·kg-1、速效磷7.38 mg·kg-1、速效鉀 51.85 mg·kg-1。

轉(zhuǎn)基因水稻及其對照種子均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供，具體信息見表1。

表1 供試轉(zhuǎn)基因水稻及其對照品種Table 1 Varieties of transgenic rice and no-transgenic rice

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)轉(zhuǎn)基因水稻和對照品種共4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)面積為150 m2。

試驗(yàn)于2010年7月5日開始，每隔15 d采樣1次，共采樣5次。采用對角線五點(diǎn)取樣，每個(gè)樣點(diǎn)于5～10 cm土層取樣，分別將各點(diǎn)土樣按四分法混合均勻，過2 mm篩后裝入滅菌封口袋，貼好標(biāo)簽，置于4℃保存，其中，用于提取微生物總DNA的土壤于-20℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落分析 采用常規(guī)方法培養(yǎng)微生物，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌用馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基，放線菌用高氏1號培養(yǎng)基，用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)數(shù)量。微生物數(shù)量均以單位土壤(干重)產(chǎn)生的菌落數(shù)表示:

細(xì)菌(真菌、放線菌)數(shù)/(cfu·g-1dry soil)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土所占百分比。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物遺傳多樣性分析 (1)轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物總DNA的提取。稱取保存于-20℃的新鮮土壤樣品 5 g，參照 Zhouet al.(1996)和張瑞福等(2003)的方法，并做適當(dāng)修改。

(2)PCR擴(kuò)增。采用嵌套PCR。第一套PCR:用細(xì)菌的16S rDNA通用引物8F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')和1492R(5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 對全長進(jìn)行擴(kuò)增(Muckianet al.，2007)。反應(yīng)體系(25 L):土壤總DNA(稀釋1000倍)1 L、引物各(10 pmol·L-1)1 L、Premix ExTaq聚合酶(5 U·L-1)12.5 L。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

第二套 PCR:用引物 F341GC(5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')和R534(5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3 區(qū)(Muyzeret al.，1993)。反應(yīng)體系(25 L):第 一 套 PCR 產(chǎn) 物 1 L、引 物 各(10 pmol·L-1)1 L、Premix ExTaq聚合酶(5 U·L-1)12.5 L。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

(3)PCR-DGGE。采用Bio Rad電泳系統(tǒng)，制備變性劑梯度為30%～60%的12%聚丙烯酰胺凝膠，在60℃、150 V條件下電泳300 min，然后用SYBRTMGreen染色30 min并攝像，得到DGGE圖譜。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

(4)DGGE的特異條帶分析。采用Quantity One分析軟件(Bio-Rad)對DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析，得到各個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品種與其對照土壤之間的細(xì)菌組成相似性。

1.2.3 土壤微生物群落功能多樣性測定 (1)Biolog Eco微平板接種及培養(yǎng)。稱取10 g新鮮土樣放入250 mL三角瓶中，加入90 mL滅菌的0.85%NaCl溶液，28℃、200 r·min-1條件下黑暗振蕩10 min。將土懸液稀釋至1000倍后接種到Biolog Eco微平板中，每孔150 mL，于恒溫培養(yǎng)箱［(28±1)℃］中培養(yǎng)，并分別于24、48、72、96、120、144、168 h用Biolog讀數(shù)儀測定590 nm下每孔的光密度。

(2)Biolog Eco微平板每孔的平均顏色變化率(average well color development，AWCD)。用 Biolog Eco微平板培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。微生物整體活性指標(biāo)采用 AWCD來表示，計(jì)算方法(Garland ＆ Mills，1991)如下:

AWCD=Σ(C-R)/n

式中:C為有培養(yǎng)基孔的光密度;R為對照孔的光密度;n為培養(yǎng)基數(shù)據(jù)，Eco板n值為31，重復(fù)3次。

(3)土壤微生物多樣性指數(shù)的計(jì)算。用Biolog Eco微平板培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落功能多樣性分析。土壤微生物群落功能多樣性以 Shannon 指數(shù)(H')(Zaket al.，1994;Lupwayiet al.，2001)、Shannon 均勻度(E)(Lupwayiet al.，2001)、Simpson指數(shù)(1/D)、Mclntosh指數(shù)(u)來表征:

式中:pi為第i孔相對光密度(C-R)與整個(gè)平板相對光密度總和的比率;S為被微生物群落利用的碳源數(shù)目;ni為第i孔相對光密度(C-R);N為光密度總和。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，用LSD進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

轉(zhuǎn)基因水稻與其對照土壤中各微生物數(shù)量隨時(shí)間的變化，均表現(xiàn)一樣的動態(tài)趨勢(圖1～4)。細(xì)菌和放線菌數(shù)量呈逐漸上升趨勢，抽穗期到達(dá)高峰，成熟期又下降到苗期水平;而真菌數(shù)量一直呈上升趨勢，成熟期達(dá)到最高峰。從土壤微生物的組成來看，細(xì)菌、真菌、放線菌的組成比例大體一致，數(shù)量上以細(xì)菌、放線菌為主，真菌最少。F檢驗(yàn)結(jié)果表明，在分蘗期、孕穗期、抽穗期，轉(zhuǎn)雙價(jià)基因水稻8km732的土壤細(xì)菌數(shù)量顯著高于其對照(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)單價(jià)基因水稻B4b68與其對照間無顯著差異(P＞0.05);不同生育期不同轉(zhuǎn)基因水稻品種間的土壤細(xì)菌數(shù)量無顯著差異(P＞0.05)。轉(zhuǎn)基因水稻對土壤真菌、放線菌數(shù)量的影響無顯著差異(P＞0.05)，且8km732和B4b68間的土壤真菌、放線菌數(shù)量無顯著差異(P＞0.05)。由此可見，轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響主要體現(xiàn)在對細(xì)菌的影響上，且集中在水稻生長發(fā)育中期。這與吳偉祥等(2003)和Wuet al.(2004)在實(shí)驗(yàn)室條件下，采用秸稈還土法比較Bt水稻及其親本對土壤微生物群落影響的結(jié)果一致。

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物遺傳多樣性的影響

2.2.1 轉(zhuǎn)基因水稻土壤16S rDNA的套式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 土壤微生物總DNA電泳顯示，在23 kb左右處有一明顯條帶(圖5)。用引物8F和1492R對總DNA的16S rDNA全序列進(jìn)行第一套PCR擴(kuò)增，得到一條清晰的1500 bp左右和一條模糊的2000 bp左右的條帶(圖6)。以第一套PCR產(chǎn)物為模板DNA，用引物F341GC和R534進(jìn)行V3段的PCR擴(kuò)增(圖7)，得到的目標(biāo)帶為200 bp左右，且條帶惟一，可以進(jìn)行DGGE分析。

2.2.2 DGGE分析 將第二套PCR產(chǎn)物通過DGGE分析，得到如圖8所示的圖譜。不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌種群(Konstantinovet al.，2003)，條帶越多，說明細(xì)菌種群越多(Muyzeret al.，1998);條帶越亮，說明細(xì)菌數(shù)量越多。用Quantity One分析軟件(Bio-Rad)自動識別條帶后，可以看出，無論是轉(zhuǎn)雙價(jià)基因還是轉(zhuǎn)單價(jià)基因水稻，與其對照間的條帶數(shù)和條帶亮度均無較大的差異，非轉(zhuǎn)基因水稻處理的條帶稍亮一些。由此說明，轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物遺傳多樣性無顯著影響。

圖1 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻土壤細(xì)菌數(shù)量時(shí)間動態(tài)Fig.1 Temporal dynamics of soil bacteria in transgenic and non-transgenic rice fields

圖2 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻土壤真菌數(shù)量時(shí)間動態(tài)Fig.2 Temporal dynamics of soil fungi in transgenic and non-transgenic rice fields

圖3 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻土壤放線菌數(shù)量時(shí)間動態(tài)Fig.3 Temporal dynamics of soil actinomyces in transgenic and non-transgenic rice fields

圖4 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物總數(shù)時(shí)間動態(tài)Fig.4 Temporal dynamics of overall soil microbes in transgenic and non-transgenic rice fields

圖5 電泳檢測提取的總DNAFig.5 Electrophoresis of total DNA

圖6 16S rDNA第一套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.6 The first time PCR amplification products of 16S rDNA

圖7 16S rDNA第二套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.7 The second PCR amplification products of 16S rDNA

進(jìn)一步將DGGE圖譜各條帶的位置和數(shù)量進(jìn)行聚類分析(圖9)，得出轉(zhuǎn)單價(jià)基因及其對照、轉(zhuǎn)雙價(jià)基因及其對照分別聚為4類。由此可以看出，不同品種轉(zhuǎn)基因水稻間的距離大于轉(zhuǎn)基因水稻與對照間的距離，進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物遺傳多樣性的影響較小。

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物功能多樣性的影響

以氧化還原顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)的Biolog微平板技術(shù)是對土壤微生物群落碳源利用進(jìn)行定量描述的有效手段(Haacket al.，1995;Hackett＆ Griffiths，1997;Garland，1997;Smallaet al.，1998)。不同微生物對不同碳源的利用程度不同，因此，每孔的接種液呈現(xiàn)不同程度的顏色變化。用AWCD的變化率能夠準(zhǔn)確、有效地反映土壤微生物群落的活性(Howard，1997;R?llinget al.，2000;Prestonet al.，2002)。2種轉(zhuǎn)基因水稻及其對照土壤微生物在Biolog Eco微平板培養(yǎng)每24 h的AWCD如圖10所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)基因水稻在不同生長期(孕穗期、抽穗期、成熟期)，土壤微生物利用的碳源量均呈逐漸增多的趨勢，其中，72 h前增長較迅速，此后逐漸趨于平穩(wěn)。

圖8 16S rDNA基因的DGGE圖譜Fig.8 The DGGE profile of 16S rDNA gene

圖9 DGGE帶譜的聚類分析結(jié)果Fig.9 Clustering analysis results of the DGGE patterns

將2種轉(zhuǎn)基因水稻與其對照孕穗期、抽穗期、成熟期土壤微生物群落培養(yǎng)72 h的AWCD進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在孕穗期，2種轉(zhuǎn)基因水稻與其對照間的AWCD均無顯著差異(P＞0.05);在抽穗期，2種轉(zhuǎn)基因水稻與其對照間的AWCD均存在顯著差異(P＜0.05);到成熟期，這種顯著差異消失。

將培養(yǎng)72 h的轉(zhuǎn)基因水稻與其對照的土壤微生物群落多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)，結(jié)果顯示，在孕穗期，2種轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落各指數(shù)與其對照間均無顯著差異(P＞0.05);在抽穗期，僅B4b68土壤微生物群落的u顯著高于其對照(P＜0.05)，而到了成熟期，也僅有B4b68土壤微生物群落的u顯著低于其對照(P＜0.05)。由此可見，轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落功能多樣性的影響是暫時(shí)的，同時(shí)，在水稻生育旺盛期，u是一個(gè)有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落多樣性的指標(biāo)。

圖10 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落AWCD的變化Fig.10 AWCD variations of soil microbial community of transgenic and non-transgenic rice

表2 轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)的變化Table 2 Changes of diversity and evenness index of soil microbial community of transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落數(shù)量的影響主要表現(xiàn)在對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響上，且集中在水稻生長發(fā)育旺盛期(分蘗期、孕穗期、抽穗期)，到了成熟期這種影響逐漸消失;在水稻各生育期，不同品種轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物間的遺傳距離大于轉(zhuǎn)基因水稻與其對照土壤微生物間的距離，即轉(zhuǎn)基因水稻品種間土壤微生物的遺傳差異大于轉(zhuǎn)基因與其對照土壤微生物間的差異，說明2種轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落遺傳多樣性的影響并不顯著;在抽穗期，2種轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落培養(yǎng)72 h的AWCD與其對照，呈現(xiàn)顯著差異，到了成熟期，差異消失。土壤微生物群落多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)也表現(xiàn)出類似趨勢。這與轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落數(shù)量，尤其是對細(xì)菌數(shù)量的影響結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物多樣性的影響主要是由細(xì)菌引起的。此外，在水稻生長發(fā)育旺盛期，Mclntosh指數(shù)(u)能有效地區(qū)分轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落多樣性的差異。

土壤微生物是影響轉(zhuǎn)基因作物土壤中Bt殺蟲蛋白降解的主要因子之一，對評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義(王建武，2002)。盡管本試驗(yàn)表明，在水稻不同生育期，轉(zhuǎn)基因水稻及其對照對土壤細(xì)菌數(shù)量、土壤微生物遺傳多樣性及功能多樣性的影響存在一定差異，但這種顯著性差異并不持續(xù)，隨著水稻的生長發(fā)育，差異逐漸消失。由此可見，轉(zhuǎn)基因水稻釋放到土壤中的Bt殺蟲蛋白對土壤微生物沒有明顯的毒害作用。究其原因，可能由于水稻在分蘗期、孕穗期、抽穗期正處于生長發(fā)育旺盛時(shí)期，Bt殺蟲蛋白的釋放增多，土壤微生物活動也隨之增強(qiáng)，從而使土壤微生物的數(shù)量和活力發(fā)生了顯著的變化，特別是細(xì)菌數(shù)量，進(jìn)而影響土壤微生物多樣性;而到后期，土壤微生物的活力下降，使轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響變得不顯著。

由于土壤微生物的重要性和復(fù)雜性，有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物影響的評價(jià)日益成為研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，迫切需要完善其評價(jià)方法，尤其需要加強(qiáng)長期綜合調(diào)查，以及對土壤中特殊功能菌的分離、篩選和鑒定，以便了解整個(gè)土壤微生物群落的動態(tài)變化。

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