蔡俊宏，符生苗*，涂志華，鄧立群，梁 茱，陳顯釗，龔選舉

（海南省人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗部1、放療科2、病理科3，海南 海口 570311）

Survivin是1997年新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因[1]，定位于染色體17q25，為凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis，IAPs)成員之一，可通過桿狀病毒IAP重復序列(Baculoviral IAP repeat，BIR)直接與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)中的Caspase-3、Caspase-7等結合，參與抑制細胞凋亡的核心機制，使得細胞凋亡受到抑制。鼻咽癌（Nasopharyngeal Carciaoma，NPC）是我國南方和東南亞很常見的惡性腫瘤，至今發(fā)病機制仍不清楚，療效也不甚理想，5年生存率仍徘徊在50%～60%。本研究通過檢測鼻咽癌活檢組織中Survivin蛋白及mRNA的表達情況來探討凋亡抑制基因Survivin與鼻咽癌患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 44例研究病例均來自2006年5月至2007年9月海南省人民醫(yī)院耳鼻喉科門診患者鼻咽部活體組織檢查標本，經病理診斷確診，37例為低分化鱗狀細胞癌，7例為分化性非角化性癌，其中男30例、女14例，平均48歲(22～77歲)。臨床診斷分期按92福州分期，Ⅱ期11例，Ⅲ期18例，Ⅳ期15例。所有患者確診后均在我院放療科行放射治療，出院后隨訪至2010年10月。另取30例同期鼻咽部慢性炎癥組織做對照。

1.2 試劑 多聚賴氨酸玻片、兔抗人Survivin多克隆抗體、UltraSensitiveTMS-P免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。Survivin mRNA原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 方法 Survivin蛋白免疫組織化學：采用SP法檢測，石蠟包埋組織標本切片常規(guī)脫蠟水化、檸檬酸組織抗原修復液修復，內源性過氧化物酶阻斷溶液室溫孵育10 min，正常非免疫動物血清室溫孵育10 min，兔抗人Survivin多克隆抗體4℃孵育過夜，生物素標記二抗室溫孵育10 min，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育10 min，DAB顯色、蘇木素復染、脫水透明、封片，顯微鏡觀察。Survivin mRNA原位雜交：石蠟包埋組織切片后按常規(guī)方法脫蠟水化、滅活內源性酶、胃蛋白酶消化及1%多聚甲醛固定。39℃預雜交 2 h，39℃雜交過夜，37℃封閉 30 min，37℃生物素化鼠抗地高辛液反應1 h，37℃鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）反應20 min，室溫生物素化過氧化物酶孵育30 min，然后用DAB顯色、蘇木素復染、脫水透明、封片，顯微鏡觀察。在400×高倍顯微鏡下觀察腫瘤細胞5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，若鼻咽癌細胞漿或細胞核內有棕黃色顆?；虬咂瑸殛栃约毎?，計算陽性細胞占總的計數(shù)鼻咽癌細胞的百分率，＞50%為(+++)、26%～50%為(++)、6%～25%為(+)、≤5%為(-)，其中0%～25%為低表達，25%以上為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SAS8.0統(tǒng)計分析軟件對4格表數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗分析。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織中Survivin的表達情況 Survivin蛋白的表達情況：9例(-)、5例(+)、10例(++)、20例(+++)，低表達共14例，高表達共30例。30例同期鼻咽部慢性炎癥組織中僅11例表達為(+)；Survivin mRNA原位雜交情況：11例(-)、6例(+)、13例(++)、14例(+++)，低表達共17例，高表達共27例。30例同期鼻咽部慢性炎癥組織中僅10例表達為(+)，見表1。且Survivin蛋白與mRNA水平表現(xiàn)出很好的一致性，同為陰性（9例）和同為陽性（32例）的比率達到90.9%。

表1 Survivin蛋白的表達與mRNA原位雜交情況（%）

2.2 Survivin基因表達的高低與鼻咽癌患者生存時間的關系 Survivin蛋白高表達的鼻咽癌患者平均生存時間為28.9個月，明顯低于Survivin蛋白低表達者的44.5個月；Survivin mRNA高水平的鼻咽癌患者平均生存時間為29.9個月，明顯低于Survivin mRNA低水平者的40.1個月，見表2。

表2 Survivin基因表達的高低與鼻咽癌患者生存時間的關系（±s）

表2 Survivin基因表達的高低與鼻咽癌患者生存時間的關系（±s）

檢測項目 表達高低 平均生存時間(月)P值Survivin蛋白 ＜0.01 Survivin mRNA高表達低表達高表達低表達28.9±11.7 44.5±3.6 29.9±12.4 40.1±10.8＜0.01

3 討 論

細胞凋亡在生理或病理條件下都會發(fā)生，細胞內誘導途徑在促細胞凋亡信號的刺激下線粒體會釋放細胞色素C，連接并激活凋亡蛋白酶激活因子，啟動凋亡效應因子Caspase-9、Caspase-3和Caspase-7從而引起細胞凋亡[2]。在這個過程中Survivin可以直接抑制效應因子Caspase-3、Caspase-7相關核心機制來阻止細胞的凋亡[3]。除此之外，Survivin還可阻礙線粒體釋放細胞色素C，與線粒體釋放的輔助性線粒體源性Caspase激活因子SMAC（Second mitochondria-derived activation of caspase）結合，保護IAPs免于被SMAC抑制，從而起到對Caspase的間接抑制作用。Survivin一般表達于人和哺乳動物的胚胎發(fā)育組織和人類大多數(shù)腫瘤組織中，而不表達在分化成熟的成人正常組織中[4-7]。Shin等[8]的研究表明Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，而其分子靶Caspase是細胞凋亡的核心機制，能夠級聯(lián)式激活并溶解蛋白，決定細胞凋亡的變化和趨勢。張帥等[9]運用免疫組織化學和TUNEL法對51例鼻咽癌活檢組織標本進行Survivin蛋白及凋亡指數(shù)的相關研究，結果發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中Survivin蛋白表達陽性率為82.4%，其中高表達占51%，凋亡指數(shù)平均為2.6%，Survivin蛋白表達與凋亡指數(shù)存在相關性，且與患者預后具有密切的相關性（P＜0.05）。本研究結果顯示，在44例鼻咽癌中Survivin蛋白表達陽性率為79.5%，其中高表達為68.2%，Survivin mRNA的表達陽性率75.0%，其中高表達為61.4%，與上述結果相近。本課題組應用實時熒光定量RT-PCR方法檢測Survivin mRNA的表達，也發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞株、鼻咽癌活檢組織組均較鼻咽部慢性炎癥組織高（P＜0.05），研究結果已另文發(fā)表[10]。這些研究結果提示凋亡抑制基因Survivin在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有調控腫瘤細胞凋亡的重要作用。

我們通過隨訪調查了入選研究組每位患者的生存狀態(tài)，進一步研究Survivin基因表達與鼻咽癌患者預后之間的關系，從而討論Survivin作為鼻咽癌預后判斷指標的可能性。研究結果發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白高表達的鼻咽癌患者的平均生存時間為28.9個月，明顯低于低表達的44.5個月；Survivin mRNA高水平的鼻咽癌患者平均生存時間為29.9個月，明顯低于Survivin mRNA低水平者的40.1個月。Kato等[11]在食管癌中也發(fā)現(xiàn)Survivin低表達的病人平均生存時間為30個月，明顯高于Survivin高表達患者的9個月。對于鼻咽癌來說，盡管其對放射治療相對敏感，但鼻咽癌患者5年生存率仍只有50%～60%，其原因可能就是由于部分鼻咽癌細胞對放射治療存在放射抗拒。Asanuma等[12]證實了Survivin是胰管癌細胞產生放射抗拒的重要因素，而且在體外實驗中Survivin mRNA的表達量與腫瘤細胞對放射的敏感性成反比，在亞致死劑量放射線下表達增強，說明Survivin也是一種誘發(fā)放療抗拒的重要因素。這些研究結果說明Survivin高表達可以明顯影響細胞凋亡，同時也可能是腫瘤細胞對放射治療產生放療抗拒和耐受性的重要原因。此外，徐澍等[13]還應用免疫組織化學檢測了58例Ⅲ期鼻咽癌患者活檢組織p53蛋白表達情況，結果發(fā)現(xiàn)生存期＜5年者陽性率為82.1%，遠高于＞5年者的31.6%。何俠等[14]還發(fā)現(xiàn)157例鼻咽癌標中生存期＜3年者p16基因第2外顯子的缺失率為69.57%，明顯高于生存期＞3年者的29.10%（P＜0.01）。齊斌等[15]采用聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應(PCR-LDR)技術，檢測了203例晚期鼻咽癌初治患者活檢組織放化療通路或順鉑/氟尿嘧啶通路13個基因、18個SNP位點，用Kaplan-Meier法進行生存分析，Cox回歸進行多因素分析，發(fā)現(xiàn)有rs25487 AA、rs1136410 CC+TT、rs2032582 ATrs2010963 CC、rs3212986GG、rs2279744 GG+GT等6個基因型為預后的獨立危險因素(P＜0.05)。故而我們認為Survivin主要影響細胞凋亡途徑中下游效應因子Caspase-3、Caspase-7等，并與其他相關基因之間也可能有相互作用，但是它們之間的關系及鼻咽癌的確切發(fā)病機制如何，需要我們增加研究病例并延長隨訪時間進一步的研究探討。

[1] Ambrosini G,Adida C,Alteri DC.A novel anti-apotosis gene,Surviving,express in cancer and lymphoma[J].Nature Med,1997,(8):917-921.

[2] Cryns V,Yuan Y.Proteases to die for[J].Genes Dev,1999,12(11):1551-1570.

[3] Deveraux QL,Reed JC.IAP family proteins-suppressors of apoptosis[J].Genes Dev,1999,13(3):239-252.

[4] Dong Y,Sui L,Watanabe Y,et al.Survivin expression in laryngeal squamous cell carcinomas and its prognostic implications[J].Anticancer Res,2002,22(4):2377-2383.

[5] Adida C,Berrebi D,Peuchmaur M,et al.Anti-apoptosis gene,survivin,and prognosis of neuroblastoma[letter][J].Lancet,1998,351(9106):882-883.

[6] Tanaka K,Iwamoto S,Gon G,et al.Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas[J].Clin Cancer Res,2000,6(6):127-134.

[7] Lu CD,Altieri DC,Tanigawa N.Expression of a novel antiapoptosis gene,survivin,correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas[J].Cancer Res,1998,58(9):1808-1812.

[8] Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and caspase-7[J].Biochemistry，2001，40（4）：1117-1123.

[9] 張 帥，肖劍云，田勇泉，等.凋亡抑制基因survivin與鼻咽癌預后關系的研究 [J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2004，10(4):196-199.

[10] 符生苗，蔡俊宏，涂志華，等.實時熒光定量RT-PCR檢測鼻咽癌Survivin mRNA基因表達[J].實用腫瘤學雜志，2007，21(6):503-506.

[11] Kato J,Kuwabara Y,Mitani M,et al.Expression of Survivin in esophageal cancer:correlation with the prognosis and response to chemotherapy[J].Int J Cancer,2001,95(2):92-95.

[12] Asanuma K,Moriai R,Yajima T,et al.Survivin as a radioresistance factor in pancreatic cancer[J].Japan J cancer Res,2000,91(11):1204-1209.

[13] 徐 澍，張維元.Ⅲ期鼻咽癌p53蛋白表達與生物學行為及預后的關系及其與p53基因突變、潛伏膜蛋白-1表達的相關研究[J].中華病理學雜志,2001,30(6):456-459.

[14] 何 俠,宋 丹,陳森清,等.p16基因缺失與鼻咽癌預后的相關性[J].腫瘤學雜志,2009,15(4):281-283.

[15] 齊 斌,郭 翔,溫月鳳,等.放化療作用相關通路基因多態(tài)性與局部區(qū)域晚期鼻咽癌預后的關系[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17(10):755-758.