劉妍妍，于長青，王瑞輝

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319）

植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，革蘭氏陽性[1]。研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌具有降低血清膽固醇水平、降低心血管疾病發(fā)病率的良好功效[2]。在20世紀70年代，Mann和Spoerry研究發(fā)現(xiàn)，長期大量飲用當?shù)匾吧闂U菌發(fā)酵制品的非洲Masai部落人體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低[3]。迄今，已有大量實驗證實，植物乳桿菌及其相關(guān)制品具有降低介質(zhì)及血清膽固醇的能力[4，5]。

隨著物質(zhì)生活水平的提高，冠心?。–HD）和動脈粥樣硬化等心血管疾病成為目前危害人類健康、導致死亡的首要因素。研究表明，血清總膽固醇（TC）水平和冠心?。–HD）等心血管疾病發(fā)病率存在明顯的相關(guān)性。因此，通過益生菌降低血清膽固醇水平和血脂濃度成為近年來研究的熱點之一[6]，而發(fā)酵乳是益生菌最合適的載體[7]。

原料乳中膽固醇含量在0.298 mg·g-1左右，傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中膽固醇含量為0.215 mg·g-1左右。實驗采用基于體外降膽模型篩選出來的1株具有降低血清膽固醇能力的植物乳桿菌ST-Ⅲ（CGMCC No.0847），與傳統(tǒng)酸奶菌種（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）制成復合發(fā)酵劑，研究了酸奶的發(fā)酵工藝參數(shù)，并通過對比實驗研究了植物乳桿菌對產(chǎn)品中膽固醇含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

白砂糖（市售），純牛奶（市售），植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌（由黑龍江八一農(nóng)墾大學畜產(chǎn)品研究室提供），鄰苯二甲醛、冰乙酸、濃硫酸、膽固醇、甲醇、氯仿均為分析純級。

1.2 實驗設(shè)備

DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），HWS24恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），冰箱（海爾集團），MD100-2電子分析天平（上海森信實驗儀器有限公司），DHG-9145A型恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司），LRH-280生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療機械廠），XSP-2CA型顯微鏡（上海上光新光學科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵酸奶工藝流程

1.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵酸奶操作要點

（1）菌種的活化：在無菌條件下，用移液槍分別吸取1～2 mL保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌，用接種環(huán)挑取植物乳桿菌分別接種到鮮乳中，活化至活力穩(wěn)定。

（2）調(diào)制發(fā)酵劑：將鮮乳分裝于試管中和三角瓶中，每支試管中10 mL，每個三角瓶中100～150 mL，然后在120℃，5 min條件下進行高壓滅菌。將滅菌乳冷卻至42℃進行接種，接種量2%～3%，充分混勻后，將含有保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的牛乳放到42℃恒溫培養(yǎng)箱中，含有植物乳桿菌的牛乳放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 h，三角瓶中菌種供生產(chǎn)發(fā)酵劑用，試管中的菌種放入冰箱內(nèi)作為原菌種保留。

（3）原料乳殺菌：原料乳加熱到60℃后加入8%的白砂糖，待白砂糖溶解后，置于85℃的水浴鍋中殺菌30 min。

（4）冷卻：將殺菌乳移置冷卻水中冷卻，當溫度降至37～45℃時，在無菌條件下加入5%發(fā)酵劑，加入時要不斷攪拌，混勻，并活化0.5 min。

（5）灌裝：將接種好的乳快速無菌的灌裝于150 mL的容器中，容器必須事先干熱滅菌，灌裝后馬上封蓋移置42～45℃的恒溫箱中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵2.5～3 h，發(fā)酵好的酸奶凝固無流動，無乳清分離，發(fā)酵后于5℃下貯藏。

1.3.3 膽固醇含量的測定

采用鄰苯二甲醛比色法[8]。

1.3.4 植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌拮抗實驗

選用植物乳桿菌與酸乳生產(chǎn)中常用的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為酸奶發(fā)酵劑。將以上3種菌按1∶1∶1的比例接種于滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基上，放入42℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至凝乳，進行鏡檢。

1.3.5 酸奶制備工藝參數(shù)對膽固醇含量影響單因素實驗

1.3.5.1 發(fā)酵溫度對膽固醇含量的影響

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分裝在4個250 mL的三角瓶中，加3%的發(fā)酵劑，菌種比例為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶2。分別在 37、39、41、43 ℃培養(yǎng) 4 h，測定發(fā)酵后的膽固醇含量，選出最佳發(fā)酵溫度。

1.3.5.2 發(fā)酵時間對膽固醇含量的影響

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分裝在4支250 mL的三角瓶中，加3%的發(fā)酵劑，菌種比例為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶2。在41℃下，分別培養(yǎng)3、4、5、6 h測定發(fā)酵后的膽固醇含量，選出最佳發(fā)酵時間。

1.3.5.3 接種量對膽固醇含量的影響

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分裝在4支250 mL的三角瓶中，分別以1%、3%、5%、7%的接種量，41℃的溫度下發(fā)酵4 h，菌種比例為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶2。測定發(fā)酵后的膽固醇含量，選出最佳接種量。

1.3.5.4 混合菌種比例對膽固醇含量的影響

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分裝在4支250 mL的三角瓶中，以3%接種量，菌種比例分別以嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1 在 41 ℃的溫度下發(fā)酵 4 h，測定發(fā)酵后的膽固醇含量，確定最佳菌種比例。

1.3.6 酸奶制備工藝參數(shù)對膽固醇含量的影響正交實驗

以膽固醇含量為指標，通過L9（34）正交實驗，研究不同發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間，接種量及菌種比例對酸奶膽固醇含量的影響，確定最佳工藝參數(shù)。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and level of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌拮抗實驗

顯微鏡下觀察凝乳中發(fā)酵劑菌狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，3種菌形態(tài)清晰，生長良好，并且3種菌基本保持了1∶1∶1的初始比例，這表明3種菌無拮抗，能夠互利共生，可以混合作為酸乳發(fā)酵劑使用。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對膽固醇含量的影響

不同發(fā)酵溫度對酸奶中膽固醇含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對酸奶中膽固醇含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on cholesterol content in yogurt

由圖1可知，加入復合菌發(fā)酵后，不同發(fā)酵溫度下酸奶中膽固醇含量都低于正常酸奶，但在39℃下膽固醇含量最低，為 0.17 mg·g-1。

2.2.2 發(fā)酵時間對膽固醇含量的影響

不同發(fā)酵時間對酸奶中膽固醇含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對酸奶中膽固醇含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on cholesterol content in yogurt

由圖2可知，加入復合菌發(fā)酵后，不同發(fā)酵時間下酸奶中膽固醇含量都低于正常酸奶，但在5 h下膽固醇含量最低，為0.14 mg·g-1，所以最佳發(fā)酵時間為5 h。

2.2.3 接種量對膽固醇含量的影響

不同接種量對酸奶中膽固醇含量的影響見圖3。

圖3 酸奶接種量對酸奶中膽固醇含量的影響Fig.3 Effect of inoculation quantity on cholesterol content in yogurt

由圖3可知，在接種量1%～7%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加酸奶中膽固醇含量下降，接種量在5%以后，酸奶中膽固醇含量變化不明顯，所以酸奶發(fā)酵的最佳接種量是5%，膽固醇含量為0.172 mg·g-1。

2.2.4 菌種比例對膽固醇含量的影響

不同菌種比例對酸奶中膽固醇含量的影響見圖4。

圖4 混合菌種比例對酸奶中膽固醇含量的影響Fig.4 Effect of lactobacilli rate on cholesterol content in yogurt

由圖4可知，菌種比例為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶2時，酸奶中的膽固醇含量最低，為0.155 mg·g-1，隨著菌種比例的變化，酸奶中的膽固醇含量有上升的趨勢，所以最佳菌種比例為1∶1∶2。

2.3 正交實驗結(jié)果

以膽固醇含量為指標，研究發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間，接種量，菌種比例對膽固醇含量的影響，實驗結(jié)果如下。

表2 正交實驗結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal experiment

由實驗結(jié)果可知四個因素對實驗結(jié)果影響程度的主次關(guān)系是D＞C＞A>B，最優(yōu)組合為A3B1C1D2，即發(fā)酵溫度為41℃、發(fā)酵時間4 h、接種量3%、菌種比例 1∶1∶2。

2.4 驗證實驗與對比實驗

在最佳工藝條件下發(fā)酵酸奶，重復3次，以檢驗最優(yōu)工藝參數(shù)的降膽固醇的效果，其實驗結(jié)果見表3。

表3 驗證實驗結(jié)果Table 3 Results of validation experiment

由表3可知，3次重復實驗的平均值為0.122（mg·g-1）。

實驗又對沒有植物乳桿菌參與發(fā)酵的酸奶中膽固醇的含量進行了對比測定，對照樣品中3組平行樣的均值為 0.215（mg·g-1）。

3 結(jié)論

利用植物乳桿菌發(fā)酵酸奶，最佳工藝條件為發(fā)酵溫度41℃、發(fā)酵時間4 h、接種量為3%、菌種比例 1∶1∶2（嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌），酸奶具有良好的品質(zhì)，膽固醇含量為0.122 mg·g-1。

原料乳中膽固醇平均含量為0.298 mg·g-1，由嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸奶中膽固醇含量為0.215 mg·g-1，而添加植物乳桿菌的發(fā)酵酸奶膽固醇平均含量為0.122 mg·g-1，植物乳桿菌參與下的發(fā)酵工藝可使產(chǎn)品中膽固醇的含量明顯降低。

［1］金世琳.乳酸菌的科學與技術(shù)［J］.中國乳品工業(yè)，1998，26（4）：14-16.

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［3］羅冬英，尹傳武.乳酸菌制劑對人體保健功效的機理探討［J］.鄂州大學學報，2002，9（4）：53-54.

［4］趙紅霞，詹勇，許梓榮.乳酸菌的研究及其應(yīng)用［J］.江西飼料，2003（1）：9-12.

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［6］李興峰，江波，潘蓓蕾，等.產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌分離篩選及菌種鑒定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（2）：1-4.

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