劉權(quán)

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

PebC1是一種來自與灰葡萄孢菌的蛋白激發(fā)子，Genbank登陸號為FJ748868。前期研究表明，該蛋白具有提高植物綜合抗逆性的功能[1]。由于其作用機理尚未闡明，因此進一步的結(jié)構(gòu)和功能研究有待進行。而初步的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白由于自身性質(zhì)原因，如結(jié)合雜蛋白、自身形成二聚體等，難于通過純化得到高純度和高通量的蛋白，阻礙了對該蛋白功能的深入研究。

傳統(tǒng)的克隆與表達體系以表達載體的多克隆位點區(qū)為基礎(chǔ)，使用雙酶切制造粘性末端并使用T4 DNA連接酶進行連接[2-3]。而TEV-LIC克隆和表達系統(tǒng)是本實驗室依照文獻報道[4]進行改造的載體，基于pET30a原核表達載體，加入了LIC技術(shù)（Ligation Independent Clone，不依賴連接反應(yīng)的克?。┖蚑EV（Tobacco Etch Virus，煙草蝕紋病毒）蛋白酶切割位點，以及兩個供純化的親和標(biāo)簽：His（Histidine，組氨酸）和 MBP（Maltose Binding Protein，麥芽糖結(jié)合蛋白）[5-6]。在克隆時，利用T4 DNA聚合酶的外切活性制造的互補粘性末端進行自然搭接，不需要限制性內(nèi)切酶進行雙酶切；在表達時，MBP標(biāo)簽可提高蛋白的表達效率和可溶性；在純化時，利用His和MBP標(biāo)簽進行雙重純化，隨后根據(jù)需要用TEV蛋白酶切掉標(biāo)簽，得到高純度且無多余氨基酸序列的目的蛋白（圖 1）。

圖1 TEV-LIC pET30a克隆載體示意圖Fig.1 The Schematic illustration of pET30a TEV-LIC vector

在克隆時，LIC系統(tǒng)利用T4 DNA聚合酶的3’-5’的外切活性，將設(shè)計好的載體和引物切成互補的粘性末端（圖2），然后使載體和引物自然搭接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后利用大腸桿菌的復(fù)制系統(tǒng)得到連接好的表達載體質(zhì)粒。這樣的連接手段不需要使用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切和T4 DNA連接酶進行連接。

圖2 LIC體系的載體和PCR產(chǎn)物的處理過程Fig.2 The treatment process of vector and PCR products in LIC system

將PebC1通過TEV-LIC克隆與表達系統(tǒng)進行表達、純化、切去標(biāo)簽，得到了高純度的PebC1。這為PebC1的功能深入研究打下了基礎(chǔ)，也提供了蛋白純化的新思路。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

改造后的pET30a（TEV-LIC）質(zhì)粒、pET28apebC1表達質(zhì)粒為本實驗室保存；TEV酶為本實驗室純化保存；DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生化公司。

1.2 試劑與儀器

Ssp I內(nèi)切酶、T4 DNA聚合酶、Taq酶、PCR相關(guān)試劑均購自大連寶生物公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購自北京天根生化公司；Ni NTA Resin、Amylose Resin、Hitrap Q 5 mL 陰離子交換柱、Superdex20016/60分子篩購自 GE公司；AKTA Purifier蛋白純化儀購自GE公司。

1.3 pebC1克隆到表達載體

pET30a（TEV-LIC）載體質(zhì)粒使用Ssp I于37℃消化處理50 min。酶切產(chǎn)物使用膠回收試劑盒進行回收。使用T4 DNA聚合酶在加入dGTP的體系中處理，經(jīng)膠回收后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)pebC1的基因序列和pET30a（TEV-LIC）的載體序列設(shè)計引物，上游引物為（TACTTCCAATCCA ATGCCATGTCGAACCCACGT），下游引物為（TTATC CACTTCCAATGCTACTATATGCTTAGAG）。以 pET28a-pebC1表達質(zhì)粒為模板擴增pebC1基因。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃∝。產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，使用T4 DNA聚合酶在加入dCTP的體系中處理，經(jīng)膠回收后，于-20℃保存。將處理后的TEV-LIC載體質(zhì)粒和pebC1基因按照 1∶2（μL）的比例混合，于 22 ℃反應(yīng) 5 min，利用粘性末端進行自然搭接，加入1 μL 25 mM的EDTA終止反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，測序正確后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，得到pET30 a-pebC1（TEV-LIC）表達菌株。

1.4 PebC1的表達與純化

挑取PebC1表達菌的單克隆至100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中于37℃、200 r·min-1培養(yǎng)過夜。1∶100接至含1000 mL培養(yǎng)基的2 L三角瓶內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.8時加入終濃度0.4 mM的IPTG誘導(dǎo)6 h。5000 r·min-1離心收集菌體，使用Binding Buffer（50 mM Tris，500 mM NaCl，5 mM咪唑，pH8.0）懸浮菌體，超聲破碎后12000 r·min-1離心，收集上清為蛋白粗提液。

將蛋白粗提液通過Ni-NTA Resin進行His標(biāo)簽的親和純化，上樣后用Binding Buffer充分平衡柱床，用Wash Buffer（50 mM Tris，500 mM NaCl，20 mM咪唑，pH8.0）除去非特異結(jié)合的雜蛋白，最后用Elution Buffer（50 mM Tris，500 mM NaCl，150 mM 咪 唑，pH8.0）洗脫得到目的蛋白。

將收集的蛋白用超濾管替換緩沖液為MBP Binding Buffer（50 mM Tris，200 mM NaCl，pH8.0），用Amylose Resin利用MBP標(biāo)簽進行親和純化，上樣后用MBP Binding Buffer充分平衡，用MBP Wash Buffer（50 mM Tris，200 mM NaCl，2 mM Maltose，pH 8.0）除去雜蛋白，最后用 MBP Elution Buffer（50 mM Tris，200 mM NaCl，10 mM Maltose，pH8.0） 洗脫得到目的蛋白。

將收集的蛋白濃縮至約10 mg·mL-1，每mg蛋白加入10 μg的TEV蛋白酶，4℃反應(yīng)過夜，切掉標(biāo)簽。切掉標(biāo)簽后的蛋白混合液用超濾管替換緩沖液為低鹽 Buffer（50 mM Tris，50 mM NaCl，pH8.0）。使用Hitrap Q陰離子交換柱分離標(biāo)簽（His和MBP部分）和目的蛋白，NaCl濃度由50-500 mM的線性梯度進行洗脫。根據(jù)吸收峰收集目的蛋白。將目的蛋白濃縮至10 mg·mL-1，用Superdex 200分子篩進行最后的純化。SDS-PAGE電泳檢測純化所得的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 pebC1克隆到表達載體

TEV-LIC載體使用Ssp I進行平末端切割，隨后使用T4 DNA聚合酶在dGTP存在的情況下進行3’-5’的外切，遇到序列中的GTP堿基時終止反應(yīng)，得到粘性末端；pebC1基因經(jīng)過PCR擴增，使用T4 DNA聚合酶在dCTP存在的情況下進行3’-5’的外切，遇到序列中的CTP堿基時終止反應(yīng)，得到與載體相互補的粘性末端（dCTP、dGTP的作用是降低堿基序列中的CTP、GTP被T4 DNA聚合酶結(jié)合作用的概率，從而達到終止外切反應(yīng)的目的）。

經(jīng)過自然搭接，載體與目的基因的粘性末端通過兩條鏈間的堿基互補配對相連接，但是每條鏈內(nèi)部的接頭處的堿基間磷酸二酯鍵并未形成（T4 DNA連接酶才能夠催化磷酸二酯鍵的形成）。在轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞后，細(xì)菌在質(zhì)粒擴增的過程中會自然完成磷酸二酯鍵的連接。

質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后挑取陽性克隆經(jīng)過PCR檢測，電泳檢測發(fā)現(xiàn)載體內(nèi)包含目的基因（圖3）。經(jīng)測序確認(rèn)目的基因正確連接入載體。

2.2 PebC1的純化

PebC1表達菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，通過離心收集菌體，超生破碎細(xì)胞釋放目的蛋白。蛋白粗提液經(jīng)過His和MBP標(biāo)簽純化得到初步純化的蛋白；隨后使用TEV蛋白酶切割將目的蛋白與標(biāo)簽部分切開；再通過離子交換層析和分子篩將兩者分開；從而得到高純度且不帶有多余氨基酸序列的PebC1蛋白。（圖4）

圖3 pebC1插入到表達載體的PCR檢測Fig.3 The PCR detection for pebC1 inserted to expression vector

圖4 PebC1蛋白的純化Fig.4 The purification of PebC1

3 討論

研究了如何使用TEV-LIC體系將PebC1進行表達純化，并得到了高純度的目的蛋白。雖然目前PebC1的生理功能研究表明其具有提高植物綜合抗性的功能，但是其內(nèi)在的分子機理并不清楚，這需要在分子水平，尤其是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能、蛋白質(zhì)相互作用等方面進行深入研究。這些研究都需要有大量、高純度的目的蛋白作為研究材料，而本實驗則解決了這個問題，為PebC1的深入分子機理研究打下了基礎(chǔ)。

TEV-LIC克隆與表達體系與傳統(tǒng)的體系相比，具有以下優(yōu)點：（1）不需要進行雙酶切處理，避免了雙酶切過程中容易出現(xiàn)的星號活性問題；（2）在設(shè)計引物時不需要考慮基因內(nèi)部是否有雙酶切的限制性內(nèi)切酶切割位點，適用性廣；（3）連接依靠堿基配對，省去了T4 DNA連接酶進行連接的步驟，節(jié)省經(jīng)費；（4）具有雙重純化標(biāo)簽， 且能夠通過蛋白酶切去，方便純化，且最終得到不附加多余氨基酸序列的目的蛋白。因此，TEV-LIC克隆與表達體系值得在蛋白表達與純化研究中推廣使用。

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