林小滿 謝 娜 徐 楊

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇徐州 221002

Bmi-1（B-cell-specific moloney murin leukemia virus insertion site 1）基因早期發(fā)現(xiàn)在造血及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起重要作用，它維持干細(xì)胞的自我更新能力。近年來發(fā)現(xiàn)Bmi-1與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，在多種腫瘤中高表達(dá)。siRNA干擾技術(shù)是目前研究癌基因作用的常用方法，為研究Bmi-1基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)在Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，運(yùn)用siRNA干擾技術(shù)，檢測其干擾沉默Bmi-1基因的效果，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

Ishikawa細(xì)胞株（上海復(fù)祥生物科技有限公司），DMEM/F12、Opti-MEM（GIBCO公司），胰蛋白酶（南京博爾迪生物科技有限公司），RT-PCR試劑盒（Promega公司），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），Matrigel基質(zhì)膠（BD公司），RT-PCR引物（上海生工生物技術(shù)有限公司合成）。Bmi-1引物序列上游為5’-TACAGAGTTCGACCTACTT-3’，下游為 5’-TGATGACCCATTTACTGA-3’，堿基對為291 bp，β-actin上游引物序列為：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物序列：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，堿基對564 bp；siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)，干擾靶序列為5’-GGTCCACTTCCATTGAAATAC-3’，質(zhì)粒載體PGPU6/GFP/Neo-Bmi-1-654以及陰性對照空載體購（上海吉瑪公司），全波長多功能酶標(biāo)儀1500于（美國Thermo fisher公司），PCR 擴(kuò)增儀 533254964（德國 eppendorf公司），分光光度計(jì)（BioPhotometer plus, Eppendorf公司），凝膠成像儀2500（Tanon公司）。

1.2 Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)

將Ishikawa 細(xì)胞株按3×105/mL的密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系為3 mL含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每48小時(shí)換液1次，將生長良好的細(xì)胞按1×105/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板中備轉(zhuǎn)染用。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染

24 h后觀察6孔板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到60%，細(xì)胞狀態(tài)良好，即可轉(zhuǎn)染。取4個(gè)1.5 mLEP管，分為AB兩組，每組2個(gè)（1號、2號）。全部EP管均加入0.25 mL opti-MEM培養(yǎng)基，向A組EP管中分別加入6 μL Lipofectamine2000，向B組1號EP管加入2.5 μg siRNA質(zhì)粒載體PGPU6/GFP/Neo，向B組2號EP管加入2.5μg空載體作為對照，均與培養(yǎng)基混勻。5 min后將A組內(nèi)的液體對應(yīng)加入B組中，輕輕混合。B組1號EP管即為干擾組，2號EP管即為對照組，室溫孵育20 min。取出六孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，將2個(gè)EP管中的轉(zhuǎn)染液對應(yīng)加入2個(gè)孔中，搖晃混勻，每孔再補(bǔ)加1.5 mL opti-MEM培養(yǎng)基，做好標(biāo)記，入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，5 h后更換完全培養(yǎng)基。24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，鏡下見約70%的細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白，說明轉(zhuǎn)染效率較高，即可用于PCR檢測。

1.4 RT-PCR法檢測Bmi-1干擾后mRNA的表達(dá)

按照Trizol說明書分別提取Ishikawa細(xì)胞RNA干擾組（轉(zhuǎn)染48 h后）、陰性對照組的Bmi-1 mRNA。試劑劑量如下：無 核 酶 水 31μL、AMV 5×Buffer10μL、dNTPS 1μL、MgSO42μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μL、TflDNA聚合酶1μL、上下游引物各1μL、提取RNA 1μL。反應(yīng)體系如下45℃45min、95℃預(yù)變性5 min后，以94℃變性30 s、57℃退火1 min和72℃延伸30s為1個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳分析。以上步驟重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，RT-PCR法檢測Bmi-1干擾后mRNA的電泳條帶灰度比值以（± s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

RT-PCR法檢測Bmi-1干擾后mRNA的表達(dá)結(jié)果，Ishikawa細(xì) 胞 RNA干 擾 組Bmi-1mRNA條 帶（泳 道1）灰度比為（0.115±0.011），陰性對照組（泳道2）條帶灰度比為（0.287±0.014），經(jīng)t檢驗(yàn)，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示RNA干擾Bmi-1后，其在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)降低了。凝膠電泳條帶見圖1。

圖1 Ishikawa細(xì)胞RNA干擾組、陰性對照組Bmi-1 mRNA的表達(dá)

3 討論

Bmi-1現(xiàn)認(rèn)為是癌基因，在人類它位于10p13，cDNA全長3 203 bp，含有10個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，其開放閱讀框編碼的蛋白含有326個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為44 000～46 000，該基因廣泛表達(dá)于多種組織中。Bmi-1屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子polycomb家族，可結(jié)合于基因組中的polycomb反應(yīng)元件，使特定靶基因轉(zhuǎn)錄沉默。Bmi-1的下游靶基因是Ink4a位點(diǎn)，其可負(fù)性調(diào)控p16和p19的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和衰老。目前認(rèn)為，Bmi-1在造血干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞中高度表達(dá)，它維持干細(xì)胞的自我更新能力，在其發(fā)育過程中起重要作用[1-2]。Bmi-1與腫瘤的發(fā)生也關(guān)系密切，在淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Bmi-1表達(dá)增強(qiáng)，并與腫瘤的惡性程度、侵襲及預(yù)后有關(guān)[3-8]。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。近幾年來RNAi研究取得了突破性進(jìn)展，由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)被廣泛用于探索基因功能和惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。外源性dsRNA通過耗能過程降解成21～23 nt的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）可以引發(fā)RNAi。siRNA表達(dá)載體快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。

本實(shí)驗(yàn)為研究bmi-1基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，首先在Ishikawa細(xì)胞中進(jìn)行了siRNA干擾實(shí)驗(yàn)，干擾靶序列為5’-GGTCCACTTCCATTGAAATAC-3’和質(zhì)粒載體PGPU6/GFP/Neo-Bmi-1-654由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)和構(gòu)建。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后RT-PCR法檢測Bmi-1干擾后mRNA的表達(dá)，Ishikawa細(xì)胞RNA干擾組Bmi-1mRNA條帶灰度比經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示siRNA干擾Bmi-1后，其在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)降低了。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了siRNA干擾沉默Bmi-1基因技術(shù)在Ishikawa細(xì)胞中的有效性，為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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