許戟 李春溟 張森森 郜曉 屈曉燕 陳麗娟 李建勇 許家仁

多發(fā)性骨髓瘤 (multiple myeloma，MM)是以骨髓中克隆性漿細胞惡性增殖和異常積聚為特征的腫瘤。異常漿細胞浸潤骨骼和軟組織，產(chǎn)生M蛋白，引起骨骼破壞、貧血、腎功能損壞和免疫功能異常。其臨床經(jīng)過及預(yù)后差異很大，疾病呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性。核型異常是MM主要預(yù)后因素之一，最常見有13號染色體部分或全部缺失del(13q14)，是一個獨立不良預(yù)后因素［1］。目前，判斷MM患者預(yù)后的另一重要因素漿細胞標記指數(shù)(plasma cell labeling index，PCLI)在國內(nèi)尚未開展。本研究應(yīng)用免疫熒光玻片計數(shù)法檢測MM患者中PCLI，并應(yīng)用間期熒光原位雜交(interphase fluorescence in situ hybridization，I－FISH)技術(shù)檢測13q14缺失［del(13q14)］，探討PCLI與年齡、疾病分期、骨髓漿細胞數(shù)、β2－微球蛋白(β2－MG)、白蛋白、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酐、疾病無進展生存期(PFS)及del(13q14)等的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 病例 42例初治MM患者，診斷標準參照張之南主編的《血液病診斷與療效標準》［2］。根據(jù) Durie－Salmon分期和國際分期系統(tǒng)(ISS)分期法分期。男26例，女16例，年齡33～73歲，平均(56.5±7.8)歲。Durie－Salmon分期:Ⅰ期4例，Ⅱ期3例，Ⅲ期35例;ISS分期:Ⅰ期6例，Ⅱ期21例，Ⅲ期15例;根據(jù)M蛋白類型分為:IgG型24例，IgA型9例，κ輕鏈型5例，λ輕鏈型4例。

1.2 PCLI檢測 是用玻片為基礎(chǔ)的免疫熒光法來測定。密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞。每1×106細胞在37℃，1640培養(yǎng)液中孵育1 h。用PBS沖洗后，滴片，待玻片干燥用95%酒精固定10 min。加入 20 μg AMCA－Bu－1 單抗，室溫下孵育 30 min，于PBS中晃洗2 min。加入8 μg AMCA山羊抗兔IgG，室溫下孵育30 min，于PBS中晃洗2 min。加入單一特異性AMCA山羊抗人κ或λ，室溫下孵育30 min，于PBS中晃洗2 min。片干后滴加DAPⅡ 6μl，待15 min后鏡檢。在Leica DRMA2型熒光顯微鏡下計數(shù)200個胞漿染為藍色的漿細胞，以胞漿輕鏈特異性細胞核染色的細胞數(shù)≥1%定為陽性標準［3］。

1.3 MACS法分選純化漿細胞 具體參照說明書，即密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞;用PBS制備細胞懸液(每5×106個細胞加90 μl PBS);每5×106個細胞加 CD138 磁珠(Milteny，Germany)10 μl，4 ℃孵育15 min;過柱分離漿細胞，將純化的漿細胞低滲固定處理后收獲細胞，－20℃凍存。

1.4 I－FISH 采用針對13q14的特異性 DNA探針D13S319(購自北京金菩嘉)檢測13q14缺失。取－20℃儲存的染色體及對照組標本，按產(chǎn)品說明書操作，予以變性、雜交、洗片、復(fù)染，見參考文獻［4］。采用裝有CCD(冷光源照相機)的Leica DRMA2型熒光顯微鏡下行原始熒光圖像采集。每例至少觀察200個間期細胞，計數(shù)邊界清楚、無重疊、結(jié)構(gòu)完整的細胞核。對10份染色體核型正常的非血液系統(tǒng)惡性疾病患者外周血淋巴細胞進行相應(yīng)探針檢測，以陽性細胞數(shù)≥+3s作為標準。del(13q14)陽性標準為＞20%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。Fisher精確檢驗用于組間離散變量的比較，使用logistic回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCLI檢測 骨髓瘤細胞的胞漿經(jīng)κ或λ染色后，胞漿染為藍色，非瘤細胞胞漿不著色。PCLI陽性漿細胞胞核熒光染色為藍色，而陰性胞核未染色。42例患者 PCLI中位數(shù)為 0.5%(0～4.46%)，18例(42.9%)PCLI陽性，即PCLI≥1%。

2.2 del(13q14)檢測 用D13S319位點的探針檢測，42例患者中25例(58.8%)發(fā)現(xiàn)有13q14的缺失，即只見1個桔紅色信號。

2.3 PCLI與 del(13q14)的關(guān)系 18例 PCLI陽性MM患者del(13q14)陽性14例，陰性4例;24例PCLI陰性患者del(13q14)陽性12例，陰性12例。PCLI陽性患者del(13q14)發(fā)生率較陰性患者高(P＝0.006)。

2.4 PCLI與臨床參數(shù)的相關(guān)性 PCLI陽性與年齡、疾病分期、骨髓漿細胞比例、β2－MG、白蛋白、LDH、肌酐等無相關(guān)性(P值均＞0.05)，與疾病生存期(P＝0.023)和del(13q14)(P＝0.006)之間有顯著的相關(guān)性。見表1。進一步多因素分析顯示 PCLI和 del(13q14)兩者之間有強相關(guān)性(P＝0.009)。

表1 42例MM患者PCLI與各項臨床分類指標相關(guān)性的統(tǒng)計分析

2.5 PCLI與 PFS的相關(guān)性 隨訪22.5月，18例PCLI陽性患者，7例疾病進展，而24例PCLI低表達患者僅有4例疾病進展，PCLI高表達患者PFS(8.5月)短于低表達患者(13.5月，P＜0.05)，見圖1。

圖1 PCLI陽性與陰性PFS曲線比較

3 討論

PCLI特異性反應(yīng)克隆性漿細胞的增殖程度，PCLI高的患者對治療反應(yīng)快，但緩解期短，中位存活期也短。在多變量分析中，PCLI被證實是初診MM患者一個獨立的預(yù)后因素［5－6］。文獻報道PCLI陽性及陰性2組中位疾病進展時間及總生存期都明顯縮短，但PCLI陽性組縮短更明顯，表明MM進展更快，預(yù)后更差［5］。Fonseca等［1］亦證實PCLI陽性者較 PCLI陰性者生存期短，因而針對此類病人臨床應(yīng)早期強化治療，緩解后盡早移植，以期延長生存期。本研究亦發(fā)現(xiàn)PCLI陽性組與生存期短明顯相關(guān)，中位生存期僅為8.5月，部分患者化療后未獲緩解即疾病進展，失去移植機會。

del(13)是MM最常見的核型異常之一，是MM患者一個獨立的不良預(yù)后因素，常規(guī)化療緩解率低，病人生存期短［1］。Zojer［7］等采用 I－FISH 檢測 104 例 MM患者，del(13q14)的檢出率為46.2%，與Durie－Salmon分期、β2－MG及漿細胞比例密切相關(guān)。相對于正常核型而言，伴有del(13)者常屬于Ⅲ期，β2－MG及漿細胞比例明顯增高。研究表明伴有del(13)者PCLI明顯增高，而PCLI陽性率高者易發(fā)生del(13)，疾病進展快，總生存期短［1］。本文結(jié)果顯示 PCLI和 del(13q14)兩者之間有強相關(guān)性(P＝0.009)，與文獻報道相符。由此說明PCLI結(jié)合del(13q14)可準確判斷MM預(yù)后，對臨床評估病情、治療選擇可提供有力的幫助。有研究表明，此類患者適宜采用強效化療及移植，有助于降低死亡率，明顯改善預(yù)后［8－9］。因而，宜在緩解早期行干細胞移植可望獲長期生存。

多元分析顯示，PCLI陽性者與年齡、分期、β2－MG、白蛋白、血鈣、血肌酐等無明顯相關(guān)性，這與文獻不符合［1］，原因可能與研究的例數(shù)或者患者存在未檢出的復(fù)雜染色體有關(guān)。

總之，PCLI與del(13q14)作為MM患者獨立預(yù)后因素，二者相結(jié)合，必然提高該病預(yù)后判斷的準確性，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。

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［2］張之南，沈悌.血液病診斷及療效標準［M］.3版.北京:科學(xué)出版社，2007:232－235.

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