張李俊 ,張 麗 ,張跟喜 ,周勝花 ,丁馥香 ,劉 旗
(1.山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,山西太原 030032;2.揚州大學動物科學與技術學院,江蘇揚州 225009;3.山西省牧草工作站,山西太原 030001)
微衛(wèi)星是20世紀80年代末期發(fā)展起來的一種新型分子標記。微衛(wèi)星標記具有數(shù)量多、廣泛而隨機分布于整個基因組中,多態(tài)性豐富、相對保守,在進化過程中所受選擇壓小、呈孟德爾共顯性遺傳方式、檢測容易、快速等特點,被認為是各類遺傳標記中最有價值的一種[1-3]。
自微衛(wèi)星被發(fā)現(xiàn)以來,就受到家畜遺傳育種學家們的高度重視,并且充分認識到了把它作為畜種的基因組變異研究具有巨大的潛在價值。目前,它在構建遺傳連鎖圖譜、評估遺傳多樣性、繪制系統(tǒng)發(fā)生樹、疾病診斷及親子鑒定等方面顯示出巨大的優(yōu)勢,并在人和動植物的遺傳研究中得到廣泛應用。
高玉時等[4-5]研究了微衛(wèi)星標記與以隱性白羽雞和仙居雞為親本建立的資源群體的屠宰性狀、肉品質性狀之間的關系;孫桂榮等[6]研究了微衛(wèi)星標記與絲羽烏骨雞產(chǎn)蛋性狀之間的關系;徐云翔等[7]研究了微衛(wèi)星標記與波爾山羊產(chǎn)羔性狀的關系;包文斌等[8-9]研究了微衛(wèi)星標記與仙居雞12周齡體質量及肉雞腹脂率的關系。
右玉邊雞是我國著名的地方優(yōu)良品種資源,也是山西省唯一的地方雞種,具有抗嚴寒、耐粗飼、肉質優(yōu)良、蛋大等特點,是適合于我國北方養(yǎng)殖的優(yōu)良品種[10-12]。早期建立的保種場由于各種原因現(xiàn)已關閉,只有當?shù)氐霓r(nóng)戶進行少量飼養(yǎng),因此,樣本的采集受到了一定限制,對邊雞的研究工作非常少。
到目前為止,只檢索到沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院的白文林等[13]運用5個微衛(wèi)星標記對邊雞進行的研究。運用多個微衛(wèi)星位點對右玉邊雞的遺傳結構及其與生長性狀的關系進行研究是非常必要的。鑒于以上原因,我們從右玉縣山區(qū)的農(nóng)戶家中收集種蛋,在山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所進行孵化,建立了一個保種群體。
本試驗分析了右玉邊雞的遺傳多樣性,并采用方差分析法分析標記基因型與右玉邊雞12,14周齡體質量間的連鎖關系,以期找出連鎖的微衛(wèi)星標記,為體質量的QTL定位和標記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。
隨機選取山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所右玉邊雞保種群140只0世代的右玉邊雞(♂∶♀=1∶1)血樣,翅靜脈采集血樣1.5 mL,肝素鈉抗凝,置冰盒帶回實驗室,-20℃保存。采用常規(guī)苯酚-氯仿法抽提基因組DNA,對基因組DNA進行OD值測定,并計算其濃度后備用。獲得每個個體已測定的12,14周齡的體質量記錄。
選用聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推薦的29個雞微衛(wèi)星標記中的27個,另外2個參照文獻[3]的引物。引物由上海生工生物公司合成。所選擇的29個微衛(wèi)星標記的名稱列于表1。
PCR擴增反應體系25 μL,包括10 μmol/L引物 2 μL;10×PCR 緩沖液 2.5 μL;2 mmol/L dNTPs 2.5 μL;5 U/μLTaq DNA 聚合酶 0.2 μL;50 ng/μL DNA 模 板 2 μL;25 mmol/L Mg2+1.5 μL,超純水 14.3 μL。
PCR擴增程序:94℃預變性6 min;94℃變性 30 s,55~60 ℃復性 30 s,72 ℃延伸 30 s,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min,10℃保存。擴增產(chǎn)物用29∶1的10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染法檢測電泳結果,UVI凝膠成像系統(tǒng)成像后分析結果。試驗所用Taq DNA聚合酶和dNTPs均購自上海生工生物公司,采用pBR322 DNA/BsuRI/Marker作為分子量的標準對照。
通過軟件ONE-Dscan分析基因片段大小,Microsatellite-Toolkit軟件計算等位基因頻率、多態(tài)信息含量、觀察雜合度與期望雜合度。
根據(jù)試驗個體微衛(wèi)星標記基因型和測定的12,14周齡體質量資料,利用SPSS 11.0軟件包中的廣義線性模型(General Linear Model,GLM)對右玉邊雞12,14周齡的體質量與29個微衛(wèi)星標記的相關性進行最小二乘方差分析。
右玉邊雞29個微衛(wèi)星標記共檢測到143個等位基因,單個位點等位基因數(shù)不等,最少的為2個(MCW0103,MCW0037),最多的為 11 個(MCW0104),平均為(4.93±2.20)個。平均多態(tài)信息含量和平均期望雜合度分別為0.516 8和0.575 0。
29個微衛(wèi)星標記與右玉邊雞的12,14周齡體質量間的方差分析結果(表1)表明,共檢測到10個微衛(wèi)星標記(MCW0206,MCW0014,ADL0278,MCW0067,MCW0123,MCW0330,MCW0069,MCW0037,MCW0222 和 ADL0112),同時對 12,14周齡體質量具有顯著或極顯著的影響(P<0.05或P<0.01);標記MCW0034對12周齡體質量具有顯著的影響(P<0.05);標記LEI0234,MCW0165對14周齡體質量具有顯著的影響(P<0.05)。
表1 標記與右玉邊雞體質量間的方差分析結果(F值)
根據(jù)方差分析結果,對與右玉邊雞的體質量關聯(lián)顯著的9個微衛(wèi)星標記的不同基因型進行了多重比較(表2)。由于微衛(wèi)星標記MCW0034(19種),LEI0234(29種),ADL0278(15種)和MCW0069(17種)的基因型種類較多,使得很多基因型個體數(shù)較少,分析的意義不大,所以本研究未列出多重比較的結果。
此外,微衛(wèi)星標記MCW0014中基因型187/201,195/201;MCW0123 中基因型 145/149,145/155,145/159;MCW0330 中基因型 260/294,294/294分別只有1個個體,所以在進行多重比較時,對這些數(shù)據(jù)進行了處理。
從表2可以看出,12周齡時,MCW0206基因型為241/253個體的體質量顯著高于基因型為 237/243,237/237的個體(P<0.05);14周齡時,MCW0206基因型為241/253個體的體質量顯著高于基因型為237/243,237/237的個體(P<0.05)。因此,等位基因 241,253對 12,14周齡的體質量具有顯著的正效應。
12周齡時,MCW0014基因型為199/201,201/201個體的體質量顯著高于基因型為187/187,195/195 的個體 (P<0.05);基因型199/199的個體體質量介于它們之間,沒有達到顯著水平。14周齡時,MCW0014基因型為201/201的個體體質量極顯著高于基因型為187/187的個體(P<0.01),顯著高于基因型為195/195的個體(P<0.05);199/201的個體體質量顯著高于基因型為187/187的個體(P<0.05)?;蛐蜑?01/201的個體與基因型為199/201的個體之間差異不顯著。因此,等位基因201對12,14周齡的體質量具有顯著的正效應。
12周齡時,MCW0067基因型為187/187,181/187的個體體質量顯著高于基因型為183/183的個體(P<0.05),但 183/183的個體只有3個,與其他基因型之間無顯著差異;在14周齡時,MCW0067基因型為187/187,181/187的個體體質量顯著高于基因型為183/183,181/181的個體(P<0.05),等位基因187對14周齡的體質量具有顯著的正效應。
12,14周齡時,MCW0123基因型為149/153的個體體質量顯著高于其他基因型的體質量(P<0.05),但這種基因型的個體數(shù)很少,只檢測出2個;MCW0330基因型為260/270的個體體質量顯著高于基因型為270/270的個體(P<0.05);MCW0037基因型為 157/157,161/161 的2種純合型個體的體質量顯著高于雜合型157/161個體的體質量(P<0.05);MCW0222基因型為220/224的個體體質量顯著高于其他基因型的體質量(P<0.05),但這種基因型的個體數(shù)很少,只檢測出2個;ADL0112基因型為124/130的個體體質量顯著高于其他基因型的體質量(P<0.05),但這種基因型的個體數(shù)很少,只檢測出2個。
對于MCW0165,多重比較顯示,各種基因型之間無顯著差異(P>0.05)。
表2 9個微衛(wèi)星標記不同基因型在體質量上的多重比較(鄧肯氏法)
從表2比較結果可以看出,微衛(wèi)星標記MCW0014,CW0067和MCW0037的效果最好。MCW0014基因型為201/201的個體12周齡體質量分別比基因型187/187,195/195高出138.44,125.13 g(P<0.05),14周齡體質量則分別高出241.36 g(P<0.01) 和 200.07 g(P<0.05);MCW0067基因型為187/187的個體14周齡體質量分別比基因型183/183,181/181高出247.05,226.84 g(P<0.05)。MCW0037 基因型為157/157,61/161的個體12周齡體質量分別比基因型157/161 的個體高出 129.04,131.71 g(P<0.05),14周齡體質量則分別高出195.54,213.75 g(P<0.05),157/157型個體與 161/161型個體 12,14周齡體質量差異不顯著。
Tatsuda等[14-15]發(fā)現(xiàn),雞的1號染色體和3號染色體上可能存在控制雞體質量的QTLs。Gao等[16]利用分布在雞的23條常染色體和Z染色體上的125個微衛(wèi)星標記對F2資源群體進行全基因組掃描,發(fā)現(xiàn)1號染色體MCW0168和GCT0006標記間存在與體質量相關的QTL。高玉時等[4]研究發(fā)現(xiàn),在雞 8,3,5,10,13,23 號染色體上存在與活體質量顯著相關的標記。
本試驗研究中,有3個標記,即MCW0020,ADL0268,MCW0248位于1號染色體上,5個標記(MCW0103,MCW0037,MCW0222,MCW0016,LEI0166)位于3號染色體上,2個標記(MCW0095,ADL0278)位于8號染色體上,2個標記(ADL0112,MCW0067) 位 于 10號 染 色 體 ,1個 標 記(MCW0206) 位于 2號染色體上,1個標記(MCW0014)位于6號染色體上,1個標記(MCW0123) 位于 14號染色體上,1個標記(MCW0330) 位于 17號染色體上,1個標記(MCW0165) 位于 23號染色體上,1個標記(MCW0069)位于26號染色體上。方差分析顯示,標記 MCW0206,MCW0014,ADL0278,MCW0067,MCW0123,MCW0330,MCW0069,MCW0037,MCW0222,ADL0112,MCW0034,LEI0234 和MCW0165對12周齡或14周齡體質量有顯著的影響,其余標記則差異不顯著。
在本研究中,多個標記對12,14周齡體質量具有顯著影響,說明體質量性狀受多個QTL控制,且效應大小不一。多重比較結果表明,微衛(wèi)星標記MCW0014,MCW0067和MCW0037的效果最好,而且這3個微衛(wèi)星標記中,157/157,161/161,201/201,187/187這4種純合型的個體都占有很大的比例,且不像雜合型個體在群體中難以固定,所以在育種實踐中,可以考慮通過選擇這樣的個體進行留種,在進行人工受精時,進行同型交配產(chǎn)生純合型的個體。標記MCW0014基因型201/201和標記MCW0037基因型157/157,161/161有望作為12,14周齡體質量的輔助標記,以提高邊雞12,14周齡的體質量。標記MCW0067基因型187/187有望作為14周齡體質量的輔助標記。
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