曹 川，包建強(qiáng)

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

貽貝不僅具有很高的食用價(jià)值，還富含蛋白質(zhì)、多聚不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗疲勞、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等保健功能。但是，隨著貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加，如何充分高效地利用貽貝資源，開發(fā)出更多更好的深加工貽貝產(chǎn)品，既是貽貝產(chǎn)業(yè)面臨的巨大機(jī)遇，也是貽貝產(chǎn)業(yè)的一個(gè)挑戰(zhàn)[1]。因此，對(duì)于貽貝深加工利用的研究也受到越來越多科研工作者的重視[2]。

本研究主要探討不同條件下不同蛋白酶對(duì)貽貝蛋白的提取性能，旨在找出一條適合于工業(yè)化生產(chǎn)的貽貝蛋白的提取工藝參數(shù)，同時(shí)也可為用酶法提取其他貝類及水產(chǎn)品蛋白提供借鑒[3]。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 原料 新鮮貽貝，產(chǎn)自嵊泗貽貝養(yǎng)殖基地。

1.1.2 試劑 木瓜蛋白酶，上海博奧生物科技有限公司產(chǎn)品；風(fēng)味蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；中性蛋白酶、胃蛋白酶、福林試劑、三氯乙酸、甲醛等均為分析純，購于國藥試劑有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 氨基酸全自動(dòng)分析儀L-8800，日立公司產(chǎn)品；凱氏定氮儀Kjeltel2300，丹麥FOSS儀器有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)粗脂肪測定儀SZF06，浙江托普儀器有限公司產(chǎn)品；酸度計(jì)METTLER TOLEDO FIVEEASY和分光光度計(jì)UV-1SOOPC SPECTROPHPTO METER，梅特勒托利多儀器有限公司產(chǎn)品；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；冰箱SHARPBCD-171D，夏普公司產(chǎn)品；CS101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱，重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)，國華電器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 貽貝蛋白提取產(chǎn)物的制備 貽貝肉→配成溶液→調(diào)pH值→蛋白酶酶解→滅酶（95℃，10min）→離心（9 000 r/min，20min）→上清液→貽貝蛋白提取產(chǎn)物。

1.2.2 常規(guī)成分的測定 總蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法[4]；氨基態(tài)氮含量測定采用甲醛滴定法（GB 5511—85）[5]；脂肪含量的測定采用索氏抽提法（GB 5497—85）[6]；水分含量測定采用105 ℃恒質(zhì)量法（GB 5512—85）[7]；灰分含量測定采用 550 ℃灼燒法（GB 5505—85）[8]；蛋白酶活力測定采用福林酚法[9]；氨基酸含量測定采用氨基酸全自動(dòng)分析儀。

1.2.3 蛋白質(zhì)回收率測定[10]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用考馬斯亮藍(lán)法[6]。樣液組分氮含量＝（A樣/A標(biāo)）×C標(biāo)。其中，A樣代表樣品的吸光度值，A標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，C標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。用凱氏定氮法分別測定上清液和酶解液中蛋白氮含量，并按下式計(jì)算：蛋白質(zhì)回收率＝（上清液總蛋白氮量÷原料總蛋白氮量）×100%。

1.2.4 中性蛋白酶優(yōu)化試驗(yàn)因素和水平 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，綜合考慮4個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)回收率影響，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案進(jìn)行響應(yīng)曲面研究，建立貽貝蛋白提取率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。pH值，加酶量，酶解溫度，酶解反應(yīng)時(shí)間 4 個(gè)自變量分別以 X1，X2，X3，X4表示（表1）。

表1 中性蛋白酶優(yōu)化試驗(yàn)因素和水平設(shè)置

2 結(jié)果與分析

2.1 貽貝的一般營養(yǎng)成分分析

稱取一定量的貽貝，分別測定蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、水分等指標(biāo)，取平均值（表2）。

表2 貽貝主要成分分析

從表2可以看出，貽貝具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，與現(xiàn)代人的食品營養(yǎng)要求比較吻合，具有較廣的消費(fèi)市場和較好的前景。由于其水分含量高，營養(yǎng)豐富，所以極易腐敗變質(zhì)，不易存儲(chǔ)。因而，研究其酶解也是非常具有現(xiàn)實(shí)意義的。

2.2 4種外加蛋白酶酶解效果的比較

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶作為外加蛋白酶，在貽貝的酶解中使用較多，本研究將4種酶進(jìn)行比較（圖1）。

由圖1可知，不同蛋白酶酶解貽貝勻漿液的蛋白質(zhì)回收率存在著較大的差異。酶解時(shí)間為120min時(shí)，中性蛋白酶的酶解物顯示出強(qiáng)的蛋白質(zhì)回收率，達(dá)51.85%；當(dāng)酶解時(shí)間分別為180，240，300min時(shí)，中性蛋白酶的酶解物都表現(xiàn)出最強(qiáng)蛋白質(zhì)回收率，其分別為51.95%，64.58%，71.87%。酶解時(shí)間為300min時(shí)，各蛋白酶酶解物的蛋白質(zhì)回收率都達(dá)到最高，故篩選出中性蛋白酶酶解貽貝蛋白。

2.3 中性蛋白酶酶解貽貝單因素試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個(gè)250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比為 1∶3，用 pH 計(jì)校正 pH 值為 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，在45℃恒溫水浴鍋中提取180min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍(lán)法在λ＝595 nm處測吸光度。重復(fù)3次，得蛋白質(zhì)回收率。由圖2可知，中性蛋白酶在pH值為6.5時(shí)，其對(duì)貽貝蛋白質(zhì)的回收率最大，可達(dá)71.05%。

分別準(zhǔn)確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個(gè)250mL三角瓶中，中性蛋白酶按照0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，料液比為 1∶3，用 pH計(jì)校正pH值至6.5。在45℃恒溫水浴鍋中提取180min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍(lán)法在λ＝595 nm處測吸光度。重復(fù)3次，得到蛋白質(zhì)回收率。

從圖3可以看出，中性蛋白酶在加酶量為0.6%時(shí)，其對(duì)貽貝蛋白質(zhì)的回收率可達(dá)71.34%。

分別準(zhǔn)確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個(gè)250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比為1∶3，用pH計(jì)校正 pH值至6.5。在 35，40，45，50，55℃恒溫水浴鍋中提取180min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍(lán)法在λ＝595 nm處測吸光度。重復(fù)3次，得蛋白質(zhì)回收率。由圖4可知，中性蛋白酶在45℃時(shí)，其對(duì)貽貝蛋白質(zhì)的回收率最大，達(dá)71.35%。

分別準(zhǔn)確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個(gè)250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比為 1∶2，1∶2.5，1∶3，1∶3.5，1∶4，用 pH 計(jì)校正pH值至6.5。在45℃恒溫水浴鍋中提取180min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍(lán)法在λ＝595 nm處測吸光度。重復(fù)3次，得蛋白質(zhì)回收率。從圖5可以看出，中性蛋白酶在料液比為1∶3時(shí)，其對(duì)貽貝蛋白質(zhì)的回收率最大，為71.02%。

分別準(zhǔn)確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個(gè)250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比為1∶3，用pH計(jì)校正pH值至6.5。在45℃恒溫水浴鍋中提取時(shí)間分別為60，120，180，240，300min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍(lán)法在λ＝595 nm處測吸光度。重復(fù)3次，得蛋白質(zhì)回收率。由圖6可知，中性蛋白酶在180min時(shí)，其對(duì)貽貝蛋白質(zhì)的回收率可達(dá)72.08%。但是隨著時(shí)間的延長，雖然蛋白質(zhì)回收率提高了，可貽貝水解液的風(fēng)味產(chǎn)生變化，綜合考慮應(yīng)選用水浴水解180min。

2.4 中性蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

利用design expert和SAS程序?qū)υ囼?yàn)進(jìn)行處理分析，回歸方程的方差分析、各項(xiàng)的方差分析和參數(shù)估計(jì)及顯著性分析的主要結(jié)果列于表3～5。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表4 回歸方程的方差分析

表5 回歸方程的各項(xiàng)方差分析

二次回歸模型F值為17.777 0，P＜0.001 0；大于在0.01水平上的F值，而交互項(xiàng)的F值為3.393 0，小于在0.05水平的F值，說明該模型擬合結(jié)果好，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的F值均大于0.01水平上的F值，說明各個(gè)因素之間的交互作用都對(duì)蛋白質(zhì)回收率有極其顯著的影響。

貽貝蛋白的蛋白質(zhì)回收率方程為：Y＝273.205 833＋49.206 667X1＋28.054 167X2＋6.235 500X3－0.385 472X4－4.907 500X12－2.425 000X2X1－34.703 125X22＋0.145 500X3X1＋0.300 000X3X2－0.059 375X32－0.011 250X4X1＋0.051 250X4X2－0.006 325X4X3－0.001 517X42。

方程的顯著性分析的F1＝17.777 0，相應(yīng)的P值為0.000 0，失擬性檢驗(yàn)分析的F2＝1.118 0，相應(yīng)的P＝0.426 0。由方程的顯著性檢驗(yàn)可知，該方程的模型達(dá)到極顯著；失擬性分析表明，該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實(shí)測值能較好地?cái)M合。

2.5 響應(yīng)面分析及提取條件的優(yōu)化

由圖7，8可知，等高線都為橢圓形，說明pH值和溫度以及溫度和加酶量兩兩之間的交互作用明顯，都對(duì)蛋白質(zhì)的回收率有影響。

由圖9～12可知，貽貝蛋白的蛋白質(zhì)回收率是先增加后降低，等高線的形狀反映出時(shí)間和加酶量，時(shí)間和pH值，時(shí)間和溫度，加酶量和pH值兩兩之間的交互作用較弱，響應(yīng)面比較陡峭說明蛋白質(zhì)回收率對(duì)時(shí)間、加酶量、溫度、pH值的變化敏感[11-13]。

為了進(jìn)一步求得各因素的最佳條件組合，通過對(duì)模型方程的求解，得到曲面的最大值為72.2%。通過以上各圖，繪出各因素對(duì)應(yīng)的三維擬合面與等高線，證實(shí)了響應(yīng)面具有最大值。并且回歸方程求導(dǎo)[14]，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即4個(gè)主要因素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為 X1＝6.3，X2＝0.75，X3＝42.9，X4＝184.9。最優(yōu)提取條件和蛋白質(zhì)回收率如表6所示。

蛋白質(zhì)回收率最高時(shí)的條件：pH值、加酶量、酶解溫度和反應(yīng)時(shí)間的具體值分別為6.3，0.75%，42.9 ℃，184.9min，該條件下得到的最大蛋白質(zhì)回收率為72.2%。為了檢測該模型預(yù)測的可靠性，按優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到預(yù)測與試驗(yàn)的偏差值為0.29%，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的試驗(yàn)參數(shù)是可靠的。

表6 中性蛋白酶提取優(yōu)化值及最優(yōu)條件下最大蛋白質(zhì)回收率

2.6 中性蛋白酶酶解前后氨基酸的變化

貽貝未加酶水解測定的氨基酸的結(jié)果為原料中氨基酸含量，經(jīng)過中性蛋白酶水解后的氨基酸含量為酶解后氨基酸的回收率（表7）。

表7 中性蛋白酶酶解過程中氨基酸的變化

利用中性蛋白酶酶解貽貝，前后氨基酸的總量有所變化，有的含量上升，有的下降，這是因?yàn)樨愵愔械陌被岚ǖ鞍踪|(zhì)中的氨基酸和游離氨基酸，提取蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸和貝類本身含有的游離氨基酸混合在一起，所以會(huì)出現(xiàn)有的氨基酸含量增加，有的氨基酸含量減少的現(xiàn)象。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法對(duì)蛋白酶提取貽貝蛋白質(zhì)回收率的關(guān)鍵因子進(jìn)行優(yōu)化。建立了蛋白質(zhì)回收率與4個(gè)關(guān)鍵因子（pH值、加酶量、溫度和時(shí)間）的二次多項(xiàng)回歸模型，經(jīng)過驗(yàn)證是合理可靠的。同時(shí)利用響應(yīng)面對(duì)關(guān)鍵因子及其相互作用進(jìn)行了分析，得出酶解條件是pH值為6.3，加酶量為0.75%，酶解溫度42.9℃和184.9min的酶解時(shí)間時(shí)，貽貝蛋白的最大蛋白質(zhì)回收率為72.2%。貽貝酶解前后氨基酸的總量變化了1.453%。該研究可以為有效科學(xué)地酶解貽貝蛋白提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

［1］郭玉華，李鈺金，吳新穎.貽貝食品的研究進(jìn)展[J].肉類研究，2009（5）：84-87.

［2］ Guérard F，Dufossé L，De La Broise D，et al.Enzymatic hydrolysis of proteins from yellowfin tuna（Thunnus albacares）wastesusing Alcalase[J].JournalofMolecular Catalysis B:Enzymatic，2001，11（4）：1051-1059.

［3］肖如武，黃駱鐮，黃克，等.不同酶水解馬氏珍珠貝蛋白的特性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009（7）：725-730.

［4］劉福嶺，戴行鈞.食品物理與化學(xué)分析方法[M].北京：輕工業(yè)出版社，1987：14-69.

［5］蔡武城，袁厚積.生物物質(zhì)常用化學(xué)分析方法[M].北京：科學(xué)出版社，1982.

［6］張水華.食品分析 [M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2007：67-69.

［7］周濤，林建利，李新勇.酶解鮐魚蛋白制取魚蛋白質(zhì)提取物的研究[J].浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，17（2）：102-108.

［8］朱志偉，曾慶孝，吳小勇.翡翠貽貝的酶法提取工藝研究[J].工藝技術(shù)，2002（10）：42-45.

［9］姜錫瑞.酶制劑應(yīng)用手冊(cè) [M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：292-297.

［10］Bhaskar N，Benila T，Radha C，etal.Optimization of enzymatic hydrolysisof visceralwaste proteinsof Catla for preparing protein hydrolysate using a commercial protease[J].Bioresource technology，2008，99（2）：335-343.

［11］吳華勇，黃贛輝，顧振宇，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化竹葉總黃酮的提取工藝研究[J].食品科學(xué)，2008，29（11）：196-200.

［12］劉春泉，劉玉花，李建軍，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化速凍紫甘薯的燙漂工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（4）：880-884.

［13］Liu JC，Shu M，Wen XC，etal.Optimization ofpolysaeeharides（ABP）extraction from the fruiting bodies of Agarieusblazei Mmillusing response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers，2009，78（2）：704-709.

［14］董江濤，李燕，蔣橙華，等.優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取葎草總黃酮的工藝研究 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（8）：63-68.