黃 洋，靳 輝，呂麗華，張春香

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

GDF-8（Growth and Differentiation Factor-8）最早于1997年McPherron等[1]研究小鼠骨骼肌cDNA文庫時發(fā)現(xiàn)，它是一種對骨骼肌生長具有負(fù)調(diào)控作用的細胞因子，該基因的突變或敲除會使動物生長速度加快、肌肉含量升高、脂肪含量減少。GDF-8基因發(fā)生自然突變的雙肌?！壤麜r藍牛[2]，其肌肉數(shù)量比一般品種多20%，且肉質(zhì)鮮嫩。因此，建立敲除GDF-8基因的轉(zhuǎn)基因動物具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

本研究分別用LipofectamineTM2000與Fu-Gene HD這2種轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)攜帶有綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的GDF-8基因干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞，探索其最佳轉(zhuǎn)染效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 表達載體與菌種 綠色熒光蛋白標(biāo)記的GDF-8基因干擾質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α，為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院遺傳育種與繁殖實驗室保存。

1.1.2 試 劑 DMEM/F12（Boster），Opti-MEM，F(xiàn)BS（GIBCO），胰蛋白酶（Solarbio），雙抗（Sigma），LipofectamineTM2000 （invitrogen），F(xiàn)uGene HD（Roche）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)液配制 基本培養(yǎng)液：在DMEM/F12中添加10%FBS和1%雙抗，此培養(yǎng)液用于綿羊成纖維細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。無抗培養(yǎng)液：在DMEM/F12中添加10%FBS，此培養(yǎng)液用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

1.2.2 綿羊成纖維細胞培養(yǎng) 取1周齡綿羊耳組織，用組織塊貼壁培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和凍存，建立綿羊成纖維細胞系[3-7]，為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提供靶細胞。

1.2.3 轉(zhuǎn)染

1.2.3.1 LipofectamineTM2000介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞條件優(yōu)化 將傳至4代已經(jīng)純化的綿羊成纖維細胞接種于96孔板中，接種密度為1×104個/孔。當(dāng)細胞匯合至約70%時，將基本培養(yǎng)液換為無抗培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，此時細胞匯合度已達到90%。

優(yōu)化步驟：（1）將不同量的質(zhì)粒 DNA（0.1，0.2，0.4，0.6μg） 和不同量的 LipofectamineTM2000（0.1，0.5，1.0，1.5μL）分別稀釋于25μL的Opti-MEM中，然后將稀釋好的質(zhì)粒DNA和LipofectamineTM2000兩兩混合構(gòu)成50μL轉(zhuǎn)染液，進行轉(zhuǎn)染，共16個處理。轉(zhuǎn)染12 h后，棄掉轉(zhuǎn)染液，更換為基本培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在熒光倒置顯微鏡下檢測每個處理表達綠色熒光蛋白的陽性細胞數(shù)。檢測時每個轉(zhuǎn)染處理組隨機選取5個視野，檢測表達綠色熒光蛋白的陽性細胞數(shù)，取其平均值。（2）用篩選出的最佳質(zhì)粒DNA用量和LipofectamineTM2000用量構(gòu)成轉(zhuǎn)染液，將轉(zhuǎn)染時間設(shè)定為 3，6，12，24，48 h，然后棄掉轉(zhuǎn)染液，更換為基本培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，熒光倒置顯微鏡下檢測不同轉(zhuǎn)染時間的陽性細胞數(shù)，用以篩選最佳轉(zhuǎn)染時間。

1.2.3.2 FuGene HD介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞條件優(yōu)化 將傳至第4代已經(jīng)純化的綿羊成纖維細胞接種于96孔板中，接種密度為1×104個/孔。按照FuGene HD試劑說明書要求控制質(zhì)粒DNA的量，篩選FuGene HD用量以及轉(zhuǎn)染液的用量。操作步驟為：（1）將2μg質(zhì)粒DNA分別和 6，8，10，12 μLFuGene HD混合后，加入Opti-MEM構(gòu)成4個梯度的轉(zhuǎn)染液，使得每個梯度轉(zhuǎn)染液終體積為100μL。（2）每孔中加入轉(zhuǎn)染液的量分別定為 5，10，20，40μL，進行轉(zhuǎn)染。不更換轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染48 h后，熒光倒置顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染陽性細胞數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lipofectam ineTM 2000介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 最佳質(zhì)粒DNA用量和LipofectamineTM2000用量 試驗結(jié)果（圖1）表明，當(dāng)質(zhì)粒DNA用量為0.4μg，LipofectamineTM2000用量1.0μL時，轉(zhuǎn)染效率最高，與其他處理之間差異達極顯著水平（P＜0.01）。

2.1.2 轉(zhuǎn)染的最佳時間 按照2.1.1篩選出的最佳質(zhì)粒DNA和LipofectamineTM2000用量，繼續(xù)篩選最佳轉(zhuǎn)染時間。結(jié)果（圖2）表明，轉(zhuǎn)染時間為6 h時，可以獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，與轉(zhuǎn)染時間為12 h時差異顯著（P＜0.05），與其余處理之間差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 FuGene HD介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞條件優(yōu)化結(jié)果

結(jié)果（圖3）表明，當(dāng)每100μL轉(zhuǎn)染液內(nèi)含2μg質(zhì)粒DNA與10μLFuGene HD，每孔內(nèi)加入轉(zhuǎn)染液5μL時能獲得最佳轉(zhuǎn)染效果，與其余處理之間差異顯著（P＜0.05）。

2.3 Lipofectam ineTM 2000與FuGene HD轉(zhuǎn)染效率比較

將以上篩選的LipofectamineTM2000最佳轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染效率與FuGene HD轉(zhuǎn)染效率比較，結(jié)果（圖4）表明，F(xiàn)uGene HD轉(zhuǎn)染效率極顯著高于 LipofectamineTM2000（P＜0.01）。熒光倒置顯微鏡觀察這2種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效果如圖5、圖6所示。

3 討論

脂質(zhì)體是借助超聲處理使復(fù)合脂質(zhì)在水溶液中膨脹形成的一種連續(xù)的雙層或多層復(fù)合脂質(zhì)組成的人工小球囊，其表面帶有正電荷，能吸附DNA的磷酸基團和帶負(fù)電荷的細胞膜。然后通過胞吞作用，使得脂質(zhì)體與DNA的復(fù)合物進入細胞，最終外源基因?qū)系郊毎蚪M上進行表達。LipofectamineTM2000是一種常用的商品化陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，由幾種陽離子脂質(zhì)體混合而成。對于多種細胞有較高的轉(zhuǎn)染效率，在基因轉(zhuǎn)染的研究中已有很多文獻[8-11]報道。

轉(zhuǎn)染試劑將外源核酸片段導(dǎo)入細胞的同時，也將影響內(nèi)源基因表達水平，從而對細胞的代謝和狀態(tài)造成不利影響，或影響試驗數(shù)據(jù)的客觀性，這稱為Off-target效應(yīng)。FuGene HD的這種效應(yīng)明顯低于LipofectamineTM2000，即FuGene HD的毒性小于LipofectamineTM2000。

體細胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是克隆技術(shù)的進一步成熟和完善，它為家畜的遺傳改良提供了一條新的途徑。對于用轉(zhuǎn)基因體細胞克隆的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物來說，從細胞轉(zhuǎn)染開始到獲得陽性克隆細胞，至少需要傳10代左右。因此，轉(zhuǎn)染試劑對細胞所造成的微小傷害都會對細胞造成嚴(yán)重影響。FuGene HD不但對細胞毒性低，而且試驗結(jié)果表明，F(xiàn)uGene HD對于綿羊成纖維細胞的轉(zhuǎn)染效率明顯高于LipofectamineTM2000。在體細胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，F(xiàn)uGene HD不失為一種優(yōu)良的轉(zhuǎn)染試劑，具有良好的應(yīng)用前景。

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