李 慧 ,田黎明 ,徐王月王月 ,蘇雪瑩

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,與多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤共同組成血液系統(tǒng)三大惡性腫瘤,發(fā)病率為2.76/10萬(wàn),與亞洲國(guó)家相近,稍低于歐洲國(guó)家水平。在惡性腫瘤死亡率中 ,白血病居第6位 (男性 )和第8位(女性),在兒童及35歲以下成人中則居第1位。其重要生物學(xué)特征是白血病細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。所以近幾年尋找能反映白血病細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物成為研究的熱點(diǎn)。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)來(lái)源于間質(zhì)細(xì)胞,其受體是原癌基因 C-met的產(chǎn)物。HGF是組織細(xì)胞分泌的含728個(gè)氨基酸的無(wú)活性的單鏈前體蛋白經(jīng)胰蛋白酶樣水解酶作用裂解成有活性的二聚體即肝素結(jié)合糖蛋白[1]。研究證明 HGF/C-met不僅參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞粘附、分化和遷移,也參與其惡性轉(zhuǎn)化?；|(zhì)金屬蛋白酶(MM Ps)家族在正常骨髓中通過(guò)調(diào)整骨髓細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖分化粘附和遷移等[2],是目前已知的唯一能夠降解膠原纖維的酶類(lèi)。由于他們對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解,從而更利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。其家族成員MM P-7更是在腫瘤細(xì)胞的凋亡中起了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中,我們用酶聯(lián)免疫法檢測(cè) HGF和 MM P-7在白血病中的表達(dá)及研究它們的相關(guān)性。從而探討它們與白血病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

50例白血病患者外周血均取自 2010— 05～ 2011— 09佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科,其中男 21例,女29例,年齡18～ 79歲,中位年齡48.5歲。白血病患者中初治 31例,復(fù)發(fā)19例。50例白血病患者均經(jīng)療程的化療治療后依據(jù)其骨髓細(xì)胞學(xué)分析分為 CR28例和 PR22例。白血病患者診斷標(biāo)準(zhǔn)參照張之南主編 《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)(第 3版)》,40例對(duì)照組標(biāo)本取自同期佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院生化實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

所有標(biāo)本均經(jīng)室溫下放置 2h后于 1000g離心20min,取上清液,將標(biāo)本放置于-20℃保存。用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)MM P-7和 HGF在白血病患者外周血中的表達(dá)用純化的抗體包被微板孔,制成固相載體,依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗 MM P-7(或 HGF)抗體、HRP標(biāo)記的親和素、經(jīng)徹底洗滌后用底物 TM B顯色。試劑盒購(gòu)自天津索羅門(mén)生物科技有限公司。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

TM B在經(jīng)過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色深淺與標(biāo)本中 (HGF或 MM P-7)的量成正相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)資料進(jìn)行 t檢驗(yàn)及 Spearman相關(guān)分析,α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MM P-7在白血病外周血清中的表達(dá)

白血病患者外周血中 HGF與 MM P-7的表達(dá)明顯高于對(duì)照組 (P＜0.05)。白血病組中,AM L與 ALL中的表達(dá)無(wú)顯著差異性 (P＞ 0.05);AM L與 CM L中的表達(dá)無(wú)顯著差異性 (P＞ 0.05);ALL與 CM L中的表達(dá)無(wú)顯著差異性(P ＞ 0.05)。見(jiàn)表1。

表1 HGF及 MMP-7在各型白血病組及對(duì)照組中的表達(dá) ±s)

表1 HGF及 MMP-7在各型白血病組及對(duì)照組中的表達(dá) ±s)

#P＜0.05,compared with the control group

2.2 MMP-7與 HGF在白血病患者外周血中的表達(dá)相關(guān)性分析

HGF與 MM P-7在白血病患者外周血清中的表達(dá)呈正相關(guān) (r= 0.303,P＜0.05),且二者關(guān)系程度較密切。

2.3 HGF與 MM P-7在初治組與復(fù)發(fā)組中的表達(dá)

白血病患者初治組與復(fù)發(fā)組患者外周血中 HGF與MM P-7的表達(dá)差異不顯著,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 HGF及 MMP-7初治組及復(fù)發(fā)組中的表達(dá) ±s)

表2 HGF及 MMP-7初治組及復(fù)發(fā)組中的表達(dá) ±s)

2.4 CR組與 PR組的比較

MM P-7與 HGF在白血病 CR組中的表達(dá)水平高于 PR組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。(見(jiàn)表3)

表3 HGF及 MMP-7在 CR組及 PR組中的表達(dá) ±s)

表3 HGF及 MMP-7在 CR組及 PR組中的表達(dá) ±s)

3 討論

本研究測(cè)定了白血病患者外周血清中 MMP-7和 HGF的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,白血病患者血清中 HGF和 MM P-7的水平均明顯高于對(duì)照組且 CR組 MM P-7和 HGF的表達(dá)水平明顯低于 PR組,差異具有顯著性。根據(jù) Liotta曾提出腫瘤轉(zhuǎn)移的“三步驟”假說(shuō)[3],惡性腫瘤細(xì)胞要想發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移所必須要攻克的屏障即是基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)。MM Ps是骨髓微環(huán)境的重要組成部分,在正常的生理?xiàng)l件下以酶原的形式直接分泌到細(xì)胞外基質(zhì),通過(guò)對(duì)除多糖外的大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)的降解而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)周?chē)M織的浸潤(rùn)[4]。另外,MM P-7通過(guò)作用于多種刺激信號(hào)而啟動(dòng)凋亡程序發(fā)揮抗凋亡作用,其如 Fas程序。腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞表面的跨膜 Fas配體(mFasl)通過(guò)與 MM P-7作用而產(chǎn)生可溶性 Fas配體(sFasl)保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避由 fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[5]。在許多實(shí)體瘤中,MMP-7蛋白的高表達(dá)與惡性腫瘤化療療效相關(guān)[6]。其機(jī)制可能與 MMp-7的抗凋亡作用有關(guān)。同時(shí) MMP-7缺少基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIM P)在 MM Ps家族的作用靶點(diǎn) C末端區(qū)域,所以目前對(duì)MM P-7的抑制劑正有待研究。所以認(rèn)為 MM P-7在白血病中的作用機(jī)制、發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移乃至白血病患者的治療上都有較廣闊的研究空間。HGF通過(guò)分解 IV型膠原、破壞基底膜,然后穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi),從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,加速癌細(xì)胞的血管內(nèi)游走和惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。Pepper[8]認(rèn)為 HGF主要是上調(diào)尿激酶及受體的基因表達(dá)水平,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的尿激酶,引起細(xì)胞外基質(zhì)的(ECM)局灶性降解,有利于細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。另外 HGF在促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生中起到了積極地作用:HGF與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體 c-Met結(jié)合可激活受體酪氨酸激酶,使β亞基磷酸化,直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮的增殖及遷移,同時(shí)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)。除此之外,HGF增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞在模擬血管生成的胞外微環(huán)境(如三維膠原)中管狀結(jié)構(gòu)形成的能力。

MM P-7和 HGF分別通過(guò)各自的方式直接或間接參與了腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。且共同降解細(xì)胞外基質(zhì)。HGF和其特異性受體 c-met通過(guò)特有的信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn) MMP的表達(dá)。Morishita[9]等研究發(fā)現(xiàn),HGF在體外誘導(dǎo)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 M T1-MM P的生成,同時(shí)可以激活 MMP-2的活性。MM P-7由于其能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,激活其他 MM P成員(MM P-2,MMp-9等 )和滅活 serpins(絲氨酸蛋白酶抑制劑),而被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明 MM P-7與 HGF在白血病患者外周血中的表達(dá)呈正相關(guān),所以我們推測(cè)白血病患者外周血中 HGF與 mmp-7之間存在一種必然聯(lián)系共同作用于白血病細(xì)胞而促進(jìn)其增殖及浸潤(rùn),二者之間具體的作用機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究。HGF及 MM P-7在白血病患者中的測(cè)定有望成為白血病的早期診斷及治療提供新的理論依據(jù)及治療新靶點(diǎn)。

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