劉中柱,馬 可,劉艷姝,王 振,張 浩

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科,黑龍江佳木斯 154003;2.一汽總醫(yī)院腎內(nèi)科,吉林 長春 130013)

膜性腎病(MN)為免疫復(fù)合物形成和沉積于腎小球基底膜 (GBM)所致,由于 MN常合并高凝狀態(tài),腎小球內(nèi)纖維蛋白沉積和微血栓形成,進(jìn)一步加重 MN的 GBM改變,使尿蛋白增加,嚴(yán)重影響 MN的治療效果及預(yù)后[1]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的表達(dá)可作為反映 MN腎活檢組織腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)標(biāo)志[2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BM P-7)在病理?xiàng)l件下亦參與了腎臟形態(tài)和功能的保護(hù)[3]。近年來不少實(shí)驗(yàn)研究表明,BM P-7在各種急慢性腎病、血管鈣化的干預(yù)治療中均可發(fā)揮重要保護(hù)作用[4]。近年來人們對(duì)低分子肝素(LMW H)的藥理作用認(rèn)識(shí)不斷深入,發(fā)現(xiàn)使用 LMW H治療 NS可減少尿蛋白,升高血漿蛋白,降低腎臟的纖維化。本實(shí)驗(yàn)主要通過研究 LMWH對(duì) MN大鼠尿蛋白的減少所發(fā)揮的作用,并探討 LMW H對(duì)大鼠腎組織中TGF-β1、BM P-7表達(dá)的影響及其可能的發(fā)生機(jī)制,從而對(duì) MN的治療起到指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立與分組

隨機(jī)將 40只大鼠隨機(jī)分為 4組,分別為空白對(duì)照組 (A組 )、模型組 (B組)、LMWH注射組 (C組)、厄貝沙坦喂養(yǎng)組(D組 ),每組 10只大鼠。各組大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周,并定性檢測尿蛋白均為陰性。按文獻(xiàn)方法造模[7],B組、C組、D組大鼠均給與 C-BSA1mg溶于 0.5mL PBS中 ,與等量不完全弗氏佐劑充分混合乳化,在大鼠雙側(cè)腋下、腹股溝處作多點(diǎn)皮下注射進(jìn)行預(yù)免疫。預(yù)免疫一周后,各組大鼠均由靜脈注射 C-BSA2.5mg,每周 3次 ,共注射 3周 ,制備 MN大鼠模型。于造模開始后第 2周即開始測定各組大鼠 24h尿蛋白,以后每隔一周采集尿液一次,分別記錄。LMW H注射組大鼠給予 LMW H300IU/100g? d,溶于 0.9%1mL生理鹽水中給大鼠進(jìn)行皮下注射;厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠給予厄貝沙坦50mg/kg每日清晨灌胃;空白對(duì)照組、模型組大鼠給與20mL/kg生理鹽水注射。以上藥物干預(yù)于第 3周末開始,共計(jì) 3周。于造模成功后第 6周末水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(共 24只,每組 6只 ),處死大鼠 ,取腎臟。

1.2 標(biāo)本的收集與處理

1.2.1 小時(shí)尿蛋白定量測定

于造模開始后第 2周即開始由代謝籠收集各組大鼠 24h尿液,由生化測定儀測定各組大鼠 24h尿蛋白,以后每隔一周采集尿液一次,分別記錄。

1.2.2 病理學(xué)檢查

于造模成功后第 6周末 10%水合氯醛 0.35g/kg腹腔注射麻醉大鼠,迅速開腹,后以生理鹽水經(jīng)腎動(dòng)脈灌洗腎臟后取腎臟。固定部分腎臟組織進(jìn)行 Masson染色。

1.2.3 Masson染色

石蠟切片,蒸鎦水洗 2次,鐵明礬 50℃下 20min,蒸鎦水洗 5次后蘇木素染色 5min,95%的乙酸洗 5次,飽和苦味酸溶液分化,自來水洗 10次。Ponceaus染色劑染色 2次,再 1%磷鉬酸分化 10次,1%醋酸洗 5次,阿尼林蘭對(duì)比染色,1%醋酸洗 5次,95%乙醇脫水,乙酸洗 3次,最后二甲苯透明,封片。

1.2.4 RT-PCR檢測

保存的腎臟組織固定于-70℃冰箱中 ,進(jìn)行 RT-PCR測定。步驟如下:

從已知 Gen-Bank序列設(shè)計(jì)鼠 TGF-β1和 GAPDH引物。引物序列如下:TGF-β 1:上游引物 5'CAG TGG CTG AAC CAA GGA GAC3';下游引物 5'CGA CCC ACG T AG TAG ACG ATG 3';擴(kuò)增產(chǎn)物為 500bp。 GAPDH:上游 5'CCA CAG TCC ATG CCA TCA CT 3';下游 5'GCC TGC TTC ACC ACC T TC TTG3';擴(kuò)增片段為 268bp,TM值為61.8。

1.2.4.1 總 RN A提取:采用大連寶生物有限公司 Biozol試劑盒,嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):在 Microtube管中配制下列混合液:dNTP Mixture 1μL,Oligo dT Primer1μL,Template RN A4 μL,5× Prime Script Buffer4μL,RNase Inhibitor 0.5μL.Prime Script RTase0.5 μL,RNase Free dH2O 9 μL,共計(jì) 20 μL。在 PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):42℃15～ 30min,95℃5 min。

1.2.4.3 PCR反應(yīng):按下列組成配制 PCR反應(yīng)液:10×PCR Buffer5μL,dNTP Mixture2μL,上游引物 0.5μL,下游引物 0.5 μL,TaKaRa Ex Taq酶 0.5 μL,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 5 μL,再加入 RNase Free dH2O使反應(yīng)液達(dá)到 50 μL。在 PCR儀上按下列條件進(jìn)行 PCR反應(yīng):94℃ 預(yù)變性 2min,94℃變性30s,55～ 65℃退火 30s,72℃引物延伸 lmin,循環(huán) 30次后72℃延伸 5min。

1.2.4.4 PCR產(chǎn)物電泳:1.5% 瓊脂糖凝膠制成厚度約為0.8cm瓊脂糖凝膠板,放入電泳槽。仔細(xì)將 5 μL PCR產(chǎn)物樣本與上樣緩沖液加入加樣槽 ,接通電源,電壓條件為 5V/cm。電泳 1h后紫外燈下觀察熒光帶 ,以 DN A marker為標(biāo)準(zhǔn) ,并應(yīng)用自動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)對(duì)每一樣品 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行光密度掃描,并以特異擴(kuò)增片段與 GAPDH條帶灰度值比值來表示其相對(duì)含量,分析電泳結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用 SPSS16.0軟件,所有指標(biāo)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差± s)表示,組間兩兩比較采用 q檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿蛋白的變化

治療 3周后 LMW H注射組、模型組、厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠尿蛋白排泄量增多,較空白對(duì)照組大鼠尿蛋白排泄量有顯著差異 (P＜0.05),LMW H注射組與模型組大鼠尿蛋白排泄量相比顯著減少 (P＜0.05);LMW H注射組與厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠相比,尿蛋白的排泄量沒有明顯差異(P＜0.05)。各組大鼠 24h尿蛋白排泄量的變化見 表1,圖 1。

表1 各組大鼠 24h尿蛋白排泄量的比較(±s,mg/24h)

表1 各組大鼠 24h尿蛋白排泄量的比較(±s,mg/24h)

注:*與正常對(duì)照組相比,P＜0.05;#與模型組相比,P＜0.05。

尿蛋白 A組 B組 C組 D組2周 3.012± 0.14613.029± 0.223* 10.665± 0.524*# 10.807± 0.207#*4周 5.362± 0.21619.529± 0.696* 18.165± 0.604*# 18.473± 0.431#*6周 6.511± 0.35923.862± 1.291* 21.331± 1.183*# 22.140± 1.661#*

2.2 LMW H對(duì) MN大鼠腎臟 BMP-7免疫組織化學(xué)染色的影響

空白對(duì)照組大鼠腎臟間質(zhì)出現(xiàn)陽性表達(dá)。 LMWH注射組、模型組、厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠腎臟間質(zhì) BM P-7的表達(dá)較空白對(duì)照組 BM P-7的表達(dá)相比顯著減少 (P＜0.05);LMWH注射組與模型組大鼠腎臟間質(zhì) BMP-7的表達(dá)相比增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);LMWH注射組與厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠相比,沒有明顯差異 (P＞ 0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎臟 BM P-7免疫組化結(jié)果(±s,n=6)

表2 各組大鼠腎臟 BM P-7免疫組化結(jié)果(±s,n=6)

*與正常對(duì)照組相比,P＜0.05;#與模型組相比,P＜0.05。

組別 BM P-7 A組 0.377± 0.047 B組 0.122± 0.054*C組 0.267± 0.378*#D組 0.250± 0.045*#

2.3 低分子肝素對(duì) MN大鼠腎臟組織 TGF-β 1mRN A表達(dá)的影響

治療 3周后低分子肝素注射組、模型組、厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠腎臟組織 TGF-β1mRN A的表達(dá)與空白對(duì)照組TGF-β 1mRN A的表達(dá)相比明顯增多 (P＜0.05);低分子肝素注射組與模型組大鼠腎臟組織 TGF-β1mRNA的表達(dá)相比減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);低分子肝素注射組與厄貝沙坦喂養(yǎng)組相比 ,沒有明顯差異 (P＞ 0.05)。說明低分子肝素注射治療 MN大鼠 3周后,可顯著降低腎組織中TGF-β1mRN A的表達(dá)。見表3。

表3 各組大鼠腎臟 TGF_β1mRN A表達(dá)的結(jié)果 ±s)

表3 各組大鼠腎臟 TGF_β1mRN A表達(dá)的結(jié)果 ±s)

注:*與正常對(duì)照組相比,P＜0.05;#與模型組相比,P＜0.05。

A組 B組 C組 D組T GF- β1mRN A 0.575±0.1091.268± 0.289* 0.819± 0.157*# 0.796±0.153*#

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用 C-BSA方法建立大鼠 MN病模型,應(yīng)用免疫組化方法觀察 BMP-7在腎組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠正常腎組織中有著豐富的 BM P-7表達(dá),在腎間質(zhì)可見陽性染色,主要分布在腎小管和集合管。而模型組大鼠腎組織中 BMP-7表達(dá)顯著下降 (P＜0.05),提示 BM P-7可能在維持正常腎結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用,而病變腎組織則會(huì)減少其表達(dá)。如前述,TGF-β 1的表達(dá)與之相反,在正常腎組織中表達(dá)甚少,而在病變腎組織中,其表達(dá)明顯增多 (P＜0.05)。上述結(jié)果表明 BM P-7確可制約 TGF-β 1的致纖維化作用,而 BM P-7蛋白表達(dá)下降很可能是 TGF-β 1mRNA表達(dá)上調(diào)促進(jìn)纖維化形成的原因之一,但是其中具體作用機(jī)制尚不清楚,還有待于進(jìn)一步研究。LMWH不僅具有抗凝、降尿蛋白及抗炎作用,更重要的是 LMW H還可抑制腎小球系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及浸潤的單核細(xì)胞釋放出各種因子刺激系膜細(xì)胞增殖和基質(zhì)增生[5]。大量的研究顯示應(yīng)用 AngⅡ受體拮抗劑類(ARB)藥物除可特異性阻斷 AngⅡ而發(fā)揮降低蛋白尿和腎臟保護(hù)作用,還可間接減少 ECM積聚,,使腎臟的 TGF-β 1的基因表達(dá)接近正常,可有效的抑制腎臟組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)和腎臟纖維化及腎功能損害,發(fā)揮腎臟保護(hù)的作用。因此,本實(shí)驗(yàn)以ARB治療 MN作為對(duì)比,以觀察 LMW H在 MN治療中的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,模型組大鼠 24h尿蛋白含量增多(P ＜0.05),而 LMWH治療后 ,大鼠 24h尿蛋白會(huì)明顯減少,說明 LMW H可有效減輕蛋白尿癥狀,可在一定程度上保護(hù)大鼠的腎臟功能。LMW H治療組大鼠腎組織中 TGF-β 1mRNA的表達(dá)明顯低于模型組大鼠腎組織中 TGF-β 1mRNA的表達(dá),而腎間質(zhì) BM P-7的表達(dá)增加,提示LMWH可能通過增加 BM P-7的表達(dá),抑制 TGF-β 1的致纖維化作用,降低腎小球的硬化及腎間質(zhì)的纖維化,從而促進(jìn) MN早期緩解。雖然 LMW H注射組與厄貝沙坦喂養(yǎng)組相比,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但 LMW H治療 MN與厄貝沙坦比較,其用藥方便,皮下注射吸收率高,為一種安全有效的治療方法。

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