石會(huì)娟 梁起保 薛 茜 鄒玉安△

1河北北方學(xué)院（河北張家口075000）

2河北省新樂市醫(yī)院（河北新樂050700）

3河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（河北張家口075000）

缺血性腦中風(fēng)主要以藥物治療為主，中藥復(fù)方以其多水平、多通道、多靶點(diǎn)治療原則備受青睞。康腦液2號(hào)主要由黃芪、當(dāng)歸、川芎、葛根、鉤藤、地龍、天麻、三七等中藥組成，以益氣活血化瘀、清熱平肝、息風(fēng)定驚為主要功能。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察康腦液2號(hào)對(duì)大鼠血清及腦組織中一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）含量的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為缺血性腦血管病的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物成年健康雄性SD大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（280±10）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2001-2008。

1.2 藥物康腦液2號(hào)主要由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、地龍、天麻、三七等組方。制備：冷水浸泡20min后，常規(guī)煎煮3次，再將3次所煎的藥汁上清液混合，文火煎濃縮至70mL。依達(dá)拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050280）。

1.3 試劑和儀器NO、NOS試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20100625）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus BX60型）LabTech-紫外分光光度計(jì)（北京萊博泰科儀器有限公司）等。

1.4 分組及造模隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、康腦液2號(hào)組（14.30g/kg·d），依達(dá)拉奉組（10.00mg/kg·d），每組 10 只。 術(shù)前 7d灌胃給藥，每日1次，每次給藥2mL（相當(dāng)于原生藥4g），假手術(shù)組、模型組灌胃等容量生理鹽水。末次灌胃后1h參照改進(jìn)Longa［1］線栓法制備大鼠MCAO模型。模型組及治療組插入栓線約18～20cm，缺血2h后將栓線拉回頸總動(dòng)脈進(jìn)行再灌注24h。假手術(shù)組不插入線栓，其余步驟同上。

1.5 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)0分，未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀；1分，不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪；2分，向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)昏迷。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)腦梗死體積測(cè)定：斷頭后立即冰浴取腦，分離并去除嗅球、小腦和低位腦干，置于-20℃冰箱冷凍20min，取出連續(xù)冠狀切片，置于2%氯化2，3，5-三苯基四氮唑（TTC）磷酸鹽緩沖液中，37℃避光恒溫孵育 30min，7～8min翻動(dòng)1次，正常腦組織染成紅色，梗死區(qū)為蒼白色，置于4%多聚甲醛溶液固定24h，拍照，分離紅色和白色區(qū)域，稱質(zhì)量并計(jì)算梗死體積。HE染色觀察組織學(xué)變化：10%水合氯醛麻醉大鼠，開胸左心室插管，灌注肝素鹽水50mL（100U/mL），迅速剪開右心耳繼續(xù)灌注4%多聚甲醛300mL，30min開顱取腦，去除小腦和腦干，從視交叉平面行4mm厚冠狀切片，將腦片放入4%多聚甲醛固定液中固定，腦片經(jīng)常規(guī)梯度脫水、透明、包埋、切片，蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。血清及腦組織NO、NOS含量測(cè)定：缺血2h再灌注24h后斷頭取血，分離血清，冰浴取腦，右側(cè)腦組織用4℃生理鹽水制成10%腦組織勻漿，3500r/min離心15min，取上清置于-80℃冰箱備用。按照試劑盒說明書測(cè)定血清以及腦組織中NO含量及NOS活力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用單因素方差分析，各項(xiàng)指標(biāo)以（±s）表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀 （P<0.05），腦缺血2h再灌注24h后神經(jīng)功能缺損癥狀最明顯；與模型組比較，康腦液2號(hào)組及依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能缺損癥狀明顯減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)果見表 1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比較 （±s）

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比較 （±s）

與假手術(shù)組比較,*P＜0.05;與模型組比較,△P＜0.05;與依達(dá)拉奉組比較,▲P＜0.05。下同。

腦梗死體積（mm3）假手術(shù)組 10 0組 別 n 神經(jīng)功能評(píng)分（分）模型組 10 2.49±0.16* 235.63±20.16*康腦液 2號(hào)組 10 1.21±0.12*△▲ 128.68±28.18*△▲依達(dá)拉奉組 10 1.62±0.14*△ 127.32±10.14*△

2.2 各組腦梗死體積比較與假手術(shù)組比較，模型組可見明顯腦梗死灶，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，康腦液2號(hào)組及依達(dá)拉奉組腦梗死體積顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表1。

2.3 各組腦組織形態(tài)學(xué)變化光鏡下觀察，假手術(shù)組大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，核仁清晰，核膜完整。模型組缺血側(cè)大腦皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞變性壞死明顯，胞體腫脹，周圍間隙增寬，結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)不同程度的變形、核深染、核固縮、核溶解、細(xì)胞壞死、間質(zhì)疏松等現(xiàn)象，神經(jīng)元細(xì)胞腫脹和間質(zhì)水腫較為明顯。與模型組比較，康腦液康腦液2號(hào)組及依達(dá)拉奉組可明顯改善上述病理變化。

2.4 各組血清及腦組織NO含量及NOS活力比較與假手術(shù)組比較，模型組血清及腦組織中NO含量及NOS活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，康腦液康腦液2號(hào)組及依達(dá)拉奉組NO含量及NOS活性顯著降低（P<0.05）。見表2、表3。

表2 各組大鼠腦組織NOS活力、NO含量比較 （±s）

表2 各組大鼠腦組織NOS活力、NO含量比較 （±s）

NO（μmol/mg）假手術(shù)組 6 2.83±0.46 85.86±13.46組 別 n NOS（U/mg）模型組 6 7.94±1.02* 192.65±10.52*康腦液2號(hào)組 6 3.49±0.38*△▲ 117.26±16.57*△▲依達(dá)拉奉組 6 3.97±0.66*△ 127.26±12.85*△

表3 各組大鼠血清NOS活力、NO含量比較 （±s）

表3 各組大鼠血清NOS活力、NO含量比較 （±s）

組 別 n假手術(shù)組 6 NOS（U/mL）18.69±3.93模型組 6康腦液2號(hào)組 6 29.63±3.64*23.25±4.75*△▲依達(dá)拉奉組 625.27±4.86*△NO（μmol/mL）39.75±8.02 79.97±4.56*43.73±7.53*△▲49.73±10.38*△

3 討 論

NO是一種新的自由基、神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)缺血性腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有著十分重要的作用。正常狀態(tài)下生物體內(nèi)NO具有內(nèi)皮源舒張因子的特性，可舒張腦血管、調(diào)節(jié)腦血流，并可作為神經(jīng)介質(zhì)參與長(zhǎng)程增強(qiáng)效應(yīng)、突觸的可塑性和記憶的形成等［2］。腦缺血再灌注損傷后，NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)所發(fā)揮的作用主要取決于NO在生物體內(nèi)的濃度、產(chǎn)生部位和時(shí)間、作用部位的不同及其氧化還原狀態(tài)等復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì)。氧化狀態(tài)的NO，能調(diào)節(jié)離子通道，減少胞質(zhì)游離Ca2+水平而發(fā)揮腦保護(hù)作用，而還原型的NO可迅速與超氧陰離子反應(yīng)生成毒性更強(qiáng)的過氧亞硝酸陰離子（ONOO-），導(dǎo)致膜功能失調(diào)；過量的NO又可通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起神經(jīng)損害，加重腦缺血損傷。NOS是合成NO的限速酶。腦缺血發(fā)生后血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）免疫陽(yáng)性表達(dá)立即增加，源于eNOS的NO對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用，能通過激活鳥苷酸環(huán)化酶使血管平滑肌舒張，抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附，增加半暗帶區(qū)腦血流量，抑制內(nèi)皮素的生成［3-4］。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，腦缺血后期，Ca2+超載可上調(diào)源于nNOS和iNOS的NO在神經(jīng)組織中的表達(dá)［5-6］，對(duì)缺血后的腦組織具有神經(jīng)毒性作用，可介導(dǎo)興奮性氨基酸（EAA）的毒性，促進(jìn)自由基生成，損傷線粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

缺血性腦血管病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，本病因患者素體氣血虧虛，與心、肝、腎陰陽(yáng)失調(diào)，加以憂思惱怒，或勞累、外邪等誘因下，致氣血運(yùn)行受阻，肌膚筋脈失于濡養(yǎng)，致陰虧于下，肝陽(yáng)暴漲，陽(yáng)化風(fēng)動(dòng)，血隨氣逆，夾痰夾火，橫竄經(jīng)絡(luò)，蒙蔽清竅而猝然昏仆，半身不遂等癥?？的X液2號(hào)是專門為氣虛血瘀患者而設(shè)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，從益氣活血的鼻祖方補(bǔ)陽(yáng)還五湯按照現(xiàn)代人特點(diǎn)化裁而來，由黃芪、當(dāng)歸、川芎、葛根、地龍、三七、丹參、天麻、鉤藤等組成，君以大量黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)，益衛(wèi)固表。當(dāng)歸善于活血養(yǎng)血，有化瘀而不傷血之妙，是為臣藥。川芎、葛根、地龍、三七、丹參等助當(dāng)歸活血化瘀，為佐藥。鉤藤、天麻引藥上行，是為使藥，君臣佐使共奏補(bǔ)氣活血化瘀之功。并且近年來各味中藥的單藥研究［7-10］表明，均有不同程度的抗自由基、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗血小板聚集、抑制微小血栓形成、減少細(xì)胞內(nèi)鈣蓄積等作用。

在臨床上，益氣活血法是治療缺血性腦卒中的常用方法，本研究采用康腦液2號(hào)組方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠進(jìn)行干預(yù)，模型組血清及腦組織勻漿中NO含量及NOS活性明顯高于假手術(shù)組，而藥物治療組血清及腦組織勻漿中NO含量及NOS活性有所降低，說明腦缺血再灌注損傷時(shí)NO可加重腦組織損傷程度，而康腦液能降低腦組織中NO的含量及NOS活性以減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。NO在缺血性腦損傷的病理過程中發(fā)揮了重要作用，并且與NOS表達(dá)的變化密切相關(guān)，康腦液2號(hào)可能通過調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷后血清及腦組織中NO、NOS表達(dá)而減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，使腦血管病的防治更進(jìn)步，為缺血性腦血管病的預(yù)防及治療提供了新的前景。

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