黃泉智 孫志高 許成勇 王發(fā)渭 陳利平

解放軍總醫(yī)院（北京100853）

抑郁癥是一種以持續(xù)情緒低落、興趣或愉快感喪失為主要癥狀的情志障礙性疾?。?］，其發(fā)病率高、嚴(yán)重危害人類身心健康，近年來(lái)已成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)到2020年抑郁障礙將成為發(fā)展中國(guó)家最嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)，人類死亡殘疾的第二大原因，女性死亡和殘疾的首位疾?。?］。中醫(yī)藥在抑郁癥的治療中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。舒郁寧心湯是臨床應(yīng)用多年治療抑郁癥的有效驗(yàn)方，本實(shí)驗(yàn)對(duì)造模成功后的抑郁模型大鼠用舒郁寧心湯進(jìn)行藥物干預(yù)，并以氟西汀作為對(duì)照，觀察抑郁模型大鼠行為學(xué)及海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物健康 SD雄性大鼠 70只 ，體質(zhì)量（200±20）g，解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，許可證編號(hào)：SLXK京2009-0007。飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±2）℃，12／12h 晝夜節(jié)律。

1.2 藥物鹽酸氟西汀分散片 （Patheon France公司產(chǎn)品，批號(hào)：9711B），20mg/粒，蒸餾水配成質(zhì)量濃度為0.4mg/mL的藥液，現(xiàn)用現(xiàn)配。舒郁寧心湯（柴胡、郁金、梔子、茯神、棗仁等藥物組成）由解放軍總醫(yī)院中藥房提供，上藥浸泡、煎煮，過(guò)濾，于80℃恒溫水浴中濃縮至含生藥5g/mL藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器甲醛、二甲苯及無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)自天津市華東試劑廠。全自動(dòng)真空脫水機(jī)（LEICA ASP300）、組織包埋機(jī)（LEICA EG1140H）、石蠟切片機(jī)（LEICA RM2135）均為德國(guó)LEICA公司產(chǎn)品。光學(xué)顯微鏡為日本Olympus BX60系統(tǒng)顯微鏡。

1.4 分組及造模70只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周（記為0周），自由攝食和飲水，期間進(jìn)行糖水訓(xùn)練（1瓶1% 糖水飲用24h，1瓶1%糖水和1瓶純水飲用24h）。在0周結(jié)束時(shí)用敞箱（openfield）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，選擇得分相近的60只大鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、氟西汀組，每組10只。造模方法：采用孤養(yǎng)加慢性輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激抑郁模型［3］并稍加改進(jìn)。正常對(duì)照組每籠飼養(yǎng)5只，正常飲食、飲水，不予任何刺激；模型組及藥物干預(yù)組每籠飼養(yǎng)1只，并接受21d慢性應(yīng)激刺激，包括：禁水（24h）、禁食（24h）、夾尾（1min）、電擊足底（20V，1s/次，間隔 1min，共 20次）、冰水游泳（4℃，4min）、傾斜籠子（45°，12h）、轉(zhuǎn)換晝夜節(jié)律（24h）、制動(dòng)（2h）、熱刺激（40℃，5min）。 每天隨機(jī)安排 1～2 種刺激，每種刺激重復(fù)2～3次。

1.5 給藥方法舒郁寧心中藥組和鹽酸氟西汀組分別按正常成人（60kg）-大鼠（200g）體表面積折算。正常對(duì)照組不給藥，模型組每日灌胃2mL生理鹽水、中藥低劑量組每日灌胃舒郁寧心湯2mL（含生藥0.5g）、中藥中劑量組每日灌胃舒郁寧心湯2mL（含生藥1.5g）、中藥高劑量組每日灌胃舒郁寧心湯2mL（含生藥5.0g）、氟西汀組每日灌胃含鹽酸氟西汀0.4mg/mL混懸液2mL。于第22日起連續(xù)給藥3周。

1.6 敞箱實(shí)驗(yàn)敞箱裝置由不透明材料制成，底面為75cm×75cm的正方形，并被等分為25個(gè)等邊方格，周圍有高45cm的周壁。將大鼠置于中心方格內(nèi)，觀察大鼠在3min內(nèi)穿越格數(shù)（三爪均進(jìn)入的方格方可記數(shù)，為水平運(yùn)動(dòng)得分）、后肢直立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運(yùn)動(dòng)得分）。每只大鼠進(jìn)行1次測(cè)定，每次3min。由2位觀察者打分，取均值。分別于0、21、42d測(cè)定。

1.7 標(biāo)本采集與檢測(cè)（1）體質(zhì)量。 分別于第 0、21、28、35、42日晨8：30測(cè)定每只大鼠體質(zhì)量。（2）進(jìn)食量。 分別于0、4、5、6周測(cè)定每只大鼠進(jìn)食量，第1日禁食24h，第2日晨8：30每只大鼠加食物50g，第3日晨8：30稱食物余量，計(jì)算24h攝食量。（3）糖水消耗。分別于第0、4、5、6周分別測(cè)定其1%蔗糖水?dāng)z取量。大鼠先禁水24h，然后每籠放定量的蔗糖水和純水各1瓶，1h后交換位置，測(cè)定2h內(nèi)糖水和純水?dāng)z取量。（4）病理組織檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后將所有大鼠用10% 水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉，暴露心臟，用約250mL生理鹽水（37℃）經(jīng)升主動(dòng)脈灌注沖洗后，灌注4%多聚甲醛溶液（4℃，pH7.4）200mL，直至動(dòng)物四肢僵硬。斷頭取腦，腦組織置于10%甲醛溶液中24h。腦組織取材后常規(guī)脫水，浸蠟包埋，切片（片厚4μm），脫蠟至水，蘇木素染色3min，自來(lái)水洗，1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水反藍(lán)，伊紅染色2min，稍水洗，過(guò)梯度酒精，二甲苯透明5min×3，中性樹膠封片。顯微鏡觀察并照相。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量、進(jìn)食量及行為學(xué)各組大鼠造模前體質(zhì)量、進(jìn)食量及行為學(xué)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。經(jīng)過(guò)21d慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激后，模型組、氟西汀組及中藥組進(jìn)食量減少，糖水消耗減少，體質(zhì)量增加緩慢，敝箱實(shí)驗(yàn)水平得分、垂直得分均顯著降低，其與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。藥物干預(yù)后，氟西汀組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組大鼠的抑郁樣行為均得到顯著改善，氟西汀組及中藥組敝箱實(shí)驗(yàn)得分、垂直得分顯著提高，糖水消耗增加，體質(zhì)量增加明顯，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

表1 各組敝箱實(shí)驗(yàn)法評(píng)分結(jié)果比較 （分，±s）

表1 各組敝箱實(shí)驗(yàn)法評(píng)分結(jié)果比較 （分，±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

組 別 n 0周 3周 6周水平運(yùn)動(dòng) 垂直運(yùn)動(dòng) 水平運(yùn)動(dòng) 垂直運(yùn)動(dòng) 水平運(yùn)動(dòng) 垂直運(yùn)動(dòng)正常對(duì)照組 10 66.83±4.62 25.33±3.44 60.00±4.98 26.83±1.84 62.00±2.37△ 25.00±2.10△模型組 10 65.88±4.09 23.00±2.73 15.00±1.60* 5.12±1.55*14.00±1.77 3.00±1.20中藥高劑量組 10 67.88±5.57 22.62±2.62 15.88±2.90* 7.00±1.85*56.88±4.22△ 21.12±2.95△中藥中劑量組 10 59.50±3.21 19.88±2.64 17.13±2.10* 6.12±1.96*52.75±3.41△ 20.86±2.17△中藥低劑量組 10 61.88±2.75 20.38±2.62 16.00±2.93* 5.13±1.55*51.00±3.38△ 19.13±3.23△氟西汀組 10 63.89±3.69 22.11±4.01 16.11±1.76* 6.11±1.90*59.78±3.03△ 22.89±2.93△

2.2 HE染色結(jié)果結(jié)果顯示慢性應(yīng)激引起海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在模型組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，排列稀疏、細(xì)胞核變形和固縮，其中CA3區(qū)更加明顯。正常對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較多，排列較整齊、密集，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，清晰可見。氟西汀和舒郁寧心中藥組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的變化介于正常對(duì)照組和模型組之間。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬HE染色CA3區(qū)切片圖（×400）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中采用的CUMS模型是國(guó)際上公認(rèn)的抑郁癥模型，主要模擬了人類抑郁的快感缺乏、運(yùn)動(dòng)能力及社會(huì)交往能力下降、探索行為能力下降、侵犯攻擊能力缺陷、性行為能力下降等癥狀，而且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道這種慢性應(yīng)激引起的抑郁狀態(tài)及行為異常可保持?jǐn)?shù)月［4］，這就為抗抑郁劑的應(yīng)用及其藥效學(xué)和作用機(jī)理的研究提供了可能。文獻(xiàn)報(bào)道慢性應(yīng)激損傷海馬神經(jīng)元的功能和結(jié)構(gòu)主要表現(xiàn)海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞萎縮和死亡、錐體細(xì)胞層變薄和稀疏。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與了情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為、免疫等的調(diào)節(jié)，它的損傷在各種應(yīng)激所致疾患種起到關(guān)鍵作用［5］。海馬的損傷可能是抑郁癥發(fā)病的重要原因。

通過(guò)行為學(xué)觀察筆者發(fā)現(xiàn)舒郁寧心中藥對(duì)抑郁模型大鼠產(chǎn)生了較好的抗抑郁效果，能提高敝箱實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)，使進(jìn)食量和糖水消耗量均較模型組增加。通過(guò)對(duì)大鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的觀察，筆者發(fā)現(xiàn)舒郁寧心中藥組的海馬神經(jīng)元細(xì)胞較模型組數(shù)量多，排列整齊，致密，細(xì)胞核變形、固縮的細(xì)胞數(shù)目少。舒郁寧心中藥可能通過(guò)促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的再生或減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞的死亡而起到抗抑郁作用。

［1］沈漁屯.精神病學(xué)［M］.4 版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：95-104，426-429，958.

［2］Duman R S，Kehne J H.Depression CNS neurol disord drug targets［J］.2007，6（3）：161-162.

［3］Winner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress and its restoration by a tricyclic antidepressant［J］.Psychopharmacology，1987，93（3）：358-364.

［4］Vry L D，Schreiber R.The chronic mild stress depression model：future developments from a drug discovery perspective［J］.Psychopharmacology，1997，134（4）：349-350.

［5］彭貴軍.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與抑郁癥的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：精神病學(xué)分冊(cè)，2004，31（3）：152.