張 蓉，侯文靜，喻 康，鄔美玉*

(1上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院，上海201400;2江蘇省常州婦幼保健院)

近年研究發(fā)現(xiàn)，約90%以上的宮頸癌組織中可檢測到人乳頭狀瘤病毒(HPV)DNA，其中高危型HPV約占60%［1］，高危型HPV感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此，國內(nèi)外婦產(chǎn)科專家建議對30歲及以上婦女進(jìn)行HPV DNA檢測及細(xì)胞學(xué)聯(lián)合的子宮頸篩查［2］，以盡早發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)生。本研究對66例宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞采用第二代雜交捕獲技術(shù)(HCⅡ)和HybriMax技術(shù)對HPV DNA進(jìn)行病毒載量和分型檢測，以探討高危型HPV DNA與宮頸癌生物學(xué)行為的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2007年10月～2011年3月在常州婦保院及我院就診，經(jīng)病理學(xué)診斷確診為宮頸癌患者66例，年齡23～63歲，其中鱗癌65例，腺癌1例;Ⅰ期38例，Ⅱ期28例;病理分級1級8例，2級55例，3級3例;33例已侵入宮頸間質(zhì)。并對其中25例患者進(jìn)行長期隨訪，術(shù)后復(fù)查高危型HPV DNA病毒載量和病毒分型。隨訪時間1個月～9 a。

1.2 儀器與試劑 HCⅡ基因雜交信號擴(kuò)大儀(DML2000)及配套HPV DNA檢測試劑盒、宮頸細(xì)胞采樣器購自美國DIGENE公司，HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀及配套HPV DNA檢測試劑盒購自香港凱普公司。

1.3 標(biāo)本采集 采用配套宮頸采樣器插入患者陰道，與宮頸口順時針旋轉(zhuǎn)3～5圈，避免宮頸分泌物及血液污染，立即浸入含保護(hù)劑的專用試管，封蓋后送至實驗室4℃冰箱保存，2周內(nèi)檢測。

1.4 HPV DNA病毒載量檢測 采用HCⅡ?qū)颊邔m頸脫落細(xì)胞HPV DNA載量進(jìn)行檢測，共檢測16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等 13 種高危型HPV。由實驗技術(shù)人員嚴(yán)格按試劑盒說明書，經(jīng)裂解—雜交—捕獲—信號放大—分析實驗步驟進(jìn)行操作，在DML2000熒光檢測儀上讀取相對光學(xué)單位(RLU)。當(dāng) RLU/陽性對照 RLU＞1.0時表示HPV DNA陽性。

1.5 HPV DNA病毒分型檢測 采用HybriMax技術(shù)對患者宮頸脫落細(xì)胞HPV DNA進(jìn)行分型檢測，檢測21種亞型，其中15種高危型為:16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68，還包括 6 種低危亞型:6、11、42、43、44 和 HPVcp8340。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗、秩和檢驗比較各組間差異。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 高危型HPV DNA陽性率及病毒載量與宮頸癌生物學(xué)行為相關(guān)性 見表1。本研究宮頸癌患者高危型HPV DNA陽性率達(dá)94%(62/66)。宮頸癌患者各臨床分期、病理分級間高危型HPV感染率無明顯差異(P＞0.05)，但病毒DNA載量臨床分期Ⅱ期明顯低于Ⅰ期，病理分級2級、3級高于1級(P＜0.05)，且發(fā)生宮頸間質(zhì)侵入的宮頸癌患者高危型HPV感染率及病毒DNA載量均上升(P＜0.05)。

表1 高危型HPV DNA陽性率及病毒載量與宮頸癌生物學(xué)行為相關(guān)性

2.2 高危型HPV DNA病毒分型與宮頸癌生物學(xué)行為相關(guān)性 見表2。本研究宮頸癌患者單一感染11例，多重感染55例，HPV16與HPV18有單一感染和多重感染兩種感染方式;而HPV33與HPV58則只見于多重感染。各臨床分期、病理分級及是否侵入間質(zhì)中，多重感染率明顯高于單一感染率，并且多重感染率與臨床分期、病理分級、是否侵入宮頸間質(zhì)有關(guān)(P ＜0.05)。

表2 高危型HPV DNA病毒分型與宮頸癌生物學(xué)行為相關(guān)性［例(%)］

2.3 術(shù)后隨訪 手術(shù)治療后隨訪宮頸癌患者25例，其中術(shù)前HPV DNA陽性24例(96%)，術(shù)后半年內(nèi)陰性20例(80%)，術(shù)后10個月開始轉(zhuǎn)陰1例(4%)，持續(xù)陽性4例(16%)。術(shù)前病毒DNA載量中位數(shù)和四分位間距分別為46.31、147.34 pg/ml，術(shù)后分別為 0.50、1.23 pg/ml，手術(shù)前后有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。術(shù)前多重感染率76%(19/25)，術(shù)后6個月內(nèi)為8%(2/25)，P ＜0.05。

3 討論

高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生的必要條件［3，4］，這一觀點已得到國內(nèi)外婦產(chǎn)科學(xué)者的共識。檢測高危型HPV DNA可從病因?qū)W水平篩選已發(fā)生或即將發(fā)生的宮頸癌病變。近年來，國內(nèi)外婦產(chǎn)科醫(yī)師開始采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行高危型HPV DNA的篩查，HCⅡ是其中發(fā)展迅速的一種簡便可靠的技術(shù)。我們應(yīng)用該技術(shù)對我院婦科疾病門診患者進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者高危型HPV陽性率高達(dá)94%，與文獻(xiàn)報道的100%相比略低［5］，可能原因:①HCⅡ技術(shù)雜交探針僅包括13種高危亞型，某些其他高危型別未包括在內(nèi);②宮頸癌組織細(xì)胞缺氧造成的壞死有可能引起高危型HPV DNA的丟失;③婦科醫(yī)生宮頸取樣方法之間的差異有可能影響到樣本中宮頸脫落細(xì)胞數(shù)量，導(dǎo)致HCⅡ檢測結(jié)果受一定的影響。

高危亞型HPV的持續(xù)性或反復(fù)感染已被確定為宮頸癌發(fā)生的最主要原因，由于不同亞型HPV其編碼外殼蛋白的基因變異很大，不同亞型HPV之間基本上沒有交叉保護(hù)抗體，容易造成不同高危型HPV多重感染或者交叉感染。Lee等［6］研究發(fā)現(xiàn)，單一HPV感染使宮頸癌的患病風(fēng)險增加19.9倍，而多重HPV感染使該風(fēng)險增加到31.8倍。我們的研究表明，在宮頸癌臨床不同分期與病理不同分級中，多重感染率明顯高于單一感染率，并且與不同分期、分級、是否侵入宮頸間質(zhì)有關(guān)，故對HPV DNA基因分型的檢測在宮頸癌的早期診斷和防治具有深遠(yuǎn)的意義。

Meta分析顯示，高危型HPV檢測是最好的子宮頸錐切后CIN復(fù)發(fā)或持續(xù)存在的預(yù)測因子［7］。本研究隨訪發(fā)現(xiàn)，96%宮頸癌患者高危型HPV DNA陽性，80%術(shù)后半年轉(zhuǎn)為陰性，但4例患者術(shù)后持續(xù)陽性，目前隨訪資料顯示，4例術(shù)后治療效果良好，但他們是否有較高的復(fù)發(fā)率，仍在進(jìn)一步的隨訪之中。

［1］Schiffman M，Castle PE，Jeronimo J，et al.Human papillomavirus and cervical cancer［J］.Lancet，2007，370(9590):890-907.

［2］Chen YY，You SL，Chen CA，et al.Effectiveness of national cervical cancer screening programme in Taiwan:12-year experiences［J］.Br J Cancer，2009，101(1):174-177.

［3］Castle PE，Rodríguez AC，Burk RD，et al.Long-term persistence of prevalently detected human papillomavirus infections in the absence of detectable cervical precancer and cancer［J］.J Infect Dis，2011，203(6):814-822.

［4］Schiffman M，Wentzensen N，Wacholder S，et al.Human papillomavirus testing in the prevention of cervical cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2011，103(5):368-383.

［5］Saini R，Shen TH，Othman NH，et al.Evaluation of polymerase chain reaction(PCR)method and hybrid capture II(HCII)assay for the detection of human papillomavirus in cervical scrapings［J］.Med J Malaysia，2007，62(3):206-209.

［6］Lee SA，Kang D，Seo SS，et al.Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA chip ［J］.Cancer Lett，2003，198(2):187-192.

［7］Frega A，Biamonti A，Maranghi L，et al.Follow-up of high-grade squamous intra-epithelial lesions(H-SIls)in human immunodeficiency virus(HIV)-positive and human papillomavirus(HPV)-positive women.analysis of risk factors［J］.Anticancer Res，2006，26(4B):3167-3170.