李 蕊，孫保存，2*，孫 丹，劉鐵菊，趙秀蘭，董學易

(1天津醫(yī)科大學病理學教研室，天津300070;2天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院)

肝癌是常見惡性腫瘤，因癌細胞血供豐富，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且治療困難，故肝癌病死率很高。腫瘤血供除來自內(nèi)皮依賴性血管外，血管生成擬態(tài)(VM)也是其來源之一。既往研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與肝癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后密切相關。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中存在 VM［1］。目前，關于VEGF-A對人肝癌細胞體外形成VM 能力的影響少見報道，2009～2011年，我們對此進行了相關研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 人肝癌細胞系PLC/PRF/5由本研究室保存;兔抗人VE-cadherin多克隆抗體、β-actin兔抗人多克隆抗體、VEGF-A購自美國;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物公司。

1．2 檢測方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肝癌細胞株，細胞長至90%融合時，以0．25%胰酶消化傳代。實驗分為正常對照組及 VEGF-A 10、30、60、100 μg/L實驗組。

1．2．2 細胞遷移檢測 將PLC細胞接種于12孔板，90%融合后，用無菌移液管尖對其表面進行劃痕，PBS沖洗細胞后，更換含5%胎牛血清培養(yǎng)基，分別加入 VEGF-A 10、30、60、100 μg/L。隨機取 5個視野，在倒置顯微鏡(×100)下觀察PLC細胞從劃痕處向中央遷移的情況，分別于0、24、48 h測量劃痕距離。

1．2．3 明膠酶譜檢測 用不同濃度VEGF-A干預PLC細胞48 h后，收集上清液行明膠酶譜檢測。以含0．1%明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，至溴酚藍進入陽極緩沖液為止，用2．5%的 Trition-X100洗膠4次，每次30 min。將膠浸入明膠酶孵育液中，37℃孵育42 h，最后用考馬斯亮藍R250染色，脫色液脫色至藍色背景下可見清晰白色條帶，對降解帶密度、面積進行測定，以降解條帶密度面積的乘積表示基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性。

1．2．4 三維培養(yǎng) 將1 cm×1 cm蓋玻片加入24孔板底壁，基質(zhì)膠與細胞培養(yǎng)基以1∶1比例混合后，取15 μl加入蓋玻片上，37℃、5%CO2溫箱放置1 h使其凝固，再加約含1×105個PLC細胞的完全培養(yǎng)液500 μl。實驗組分別加入相應濃度的 VEGF-A，將細胞置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化及管道形成情況。于倒置顯微鏡(×200)下隨機取5個視野，計數(shù)管道數(shù)量，取每個視野的均值，行3次獨立實驗。

1．2．5 VE-cadherin檢測 采用 Western blot法檢測VE-cadherin，將融合90%以上的各組PLC細胞用細胞裂解液裂解，分別提取其總蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉過夜后，分別加入VE-cadherin、β-actin，37℃孵育2 h;TBST漂洗后與山羊抗兔IgG抗體反應，37℃孵育90 min;TBST漂洗，加入發(fā)光液后顯影、定影、拍照，用Image-J軟件進行條帶灰度分析。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗，相關分析用Pearson相關分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 VEGF-A對PLC細胞遷移的影響 誘導PLC細胞 24 h 后，VEGF-A 10、30、60、100 μg/L 組劃痕寬度分別為(0．576 ± 0．005)、(0．475 ± 0．012)、(0．451 ±0．007)、(0．397 ±0．002)mm，正常對照組為(0．695±0．011)mm。VEGF-A 組細胞遷移距離明顯高于正常對照組(P均＜0．01)，且隨VEGF-A濃度升高而逐漸增加，VEGF-A 10、30、60、100 μg/L組兩兩比較 P均 ＜0．05。48 h時 VEGF-A 60、100 μg/L組劃痕損傷愈合。

2．2 VEGF-A對 PLC細胞 MMP-2、MMP-9活性的影響 正常對照組及 VEGF-A 10、30、60、100 μg/L實驗組的 MMP-2表達及活性增強均不明顯，其MMP-9表達分別為(88．674 ±9．798)、(118．792 ±10．354)、(128．563 ± 11．987)、(139．997 ±12．575)、(150．873 ±14．161)光密度;正常對照組與VEGF-A組、VEGF-A組間兩兩比較，P均＜0．05。

2．3 VEGF-A對PLC細胞形態(tài)變化及管道形成的影響 倒置顯微鏡下可見，4 h時VEGF-A各組PLC細胞呈圓形或卵圓形，部分細胞相互連接，有形成管道的趨勢;9 h時細胞均形成明顯的管道樣結構。而正常對照組均無上述改變。正常對照組及VEGFA 10、30、60、100 μg/L 實驗組 PLC 細胞管道數(shù)量分別為(0．000 ±0．000)、(4．800 ±0．100)、(7．833 ±0．153)、(8．100 ± 0．265)、(13．167 ±0．513)個/視野，正常對照組與VEGF-A組、VEGF-A組間兩兩比較，P均＜0．05。相關分析顯示，VEGF-A濃度與管道數(shù)量之間呈顯著正相關(r=0．929，P ＜0．05)。

2．4 VEGF-A對PLC細胞VE-cadherin表達的影響見圖1。

圖1 VEGF-A對PLC細胞VE-cadherin表達的影響

3 討論

VM是1999年美國學者Maniotis等［2］發(fā)現(xiàn)的獨特的腫瘤血供方式，其特點為惡性腫瘤細胞在無內(nèi)皮細胞參與下，通過自身塑形及與細胞外基質(zhì)作用形成的可為腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移提供血供的特有微循環(huán)管道，血液在此管道中流動。該管道外周是一層由厚薄不一的PAS陽性物質(zhì)構成的基底膜，并與宿主血管相通，從而使腫瘤細胞獲得血供及營養(yǎng)，以滿足其生長;由于構成管壁的腫瘤細胞直接與血液接觸，使脫落的腫瘤細胞易經(jīng)過血循環(huán)流到其他部位發(fā)生轉(zhuǎn)移，故存在VM的腫瘤患者病情進展迅速，轉(zhuǎn)移早，預后差。目前，在黑色素瘤、乳腺癌［3］、肝癌等腫瘤的體內(nèi)外實驗中均發(fā)現(xiàn)VM現(xiàn)象。

VEGF是從牛垂體濾泡星狀細胞培養(yǎng)基中分離純化的肝素結合性生長因子，由內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞和巨噬細胞等合成，通過自分泌或旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細胞表面的VEGF受體，介導血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖和遷移，增加血管通透性，為新生的毛細血管提供營養(yǎng)，促進新生血管形成。VEGF-A是VEGF家族成員，是最重要的血管生成調(diào)節(jié)因子。大量研究顯示，VEGF高表達與腫瘤微血管密度、惡性程度及患者預后不良密切相關。

目前，關于VEGF對腫瘤VM形成的作用報道不一。Xu等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在有、無VM的眼瞼皮脂腺腫瘤組織中VEGF表達無統(tǒng)計學差異，提示VM形成不依賴于VEGF。伍鋼等［5］通過轉(zhuǎn)染內(nèi)源性VEGF165到肝癌HepG2細胞進行三維培養(yǎng)，結果顯示VEGF165對HepG2細胞體外形成VM的能力無明顯影響。Wang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)VEGF-A干預后的卵巢癌細胞能在三維培養(yǎng)中形成典型的管道結構。Mei等［7］通過 siRNA沉默 VEGF基因證實，VEGF在骨肉瘤細胞形成VM過程中起重要作用，是VM形成的關鍵影響因素。

本研究顯示，不同濃度VEGF-A誘導肝癌PLC細胞后，其細胞體外侵襲、遷移和形成VM的能力均增強，且呈劑量依賴性;MMP-2在PLC細胞中的表達及其活性增強均不明顯，可能與在VEGF促進肝癌PLC細胞形成VM過程中，MMP-9比MMP-2的作用重要有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF能通過自分泌方式促進肝癌PLC細胞遷移、侵襲和VM形成，肝癌細胞模擬內(nèi)皮細胞的生物學行為圍成管道的可塑性是VM形成的分子基礎，MMP-2、MMP-9降解基底膜和細胞外基質(zhì)為腫瘤細胞塑形、圍成管道、形成VM提供一定空間，是腫瘤細胞VM形成的前提條件。

［1］Sun B，Zhang S，Zhang D，et al．Vasculogenic mimicry is associated with high tumor grade，invasion and metastasis，and short survival in patients with hepatocellular carcinoma［J］．Oncol Rep，2006，16(4):693-698．

［2］Maniotis AJ，F(xiàn)olberg R，Hess A，et al．Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry［J］．Am J Patho，1999，155(3):739-752．

［3］Clemente M，Pérez-Alenza MD，Illera JC，et al．Histological，immunohistological，and ultrastructural description of vasculogenic mimicry in canine mammary cancer［J］．Vet Pathol，2010，47(2):265-274．

［4］Xu X，Jia R，Zhou Y，et al．Investigation of vasculogenic mimicry in sebaceous carcinoma of the eyelid［J］．Acta Ophthalmol，2010，88(5):160-164．

［5］伍鋼，朱芳，李振宇，等．VEGF165在HepG2體外形成血管生成擬態(tài)中的作用［J］．腫瘤防治研究，2010，37(11):1245-1248．

［6］Wang JY，Sun T，Zhao XL，et al．Functional significance of VEGFA in human ovarian carcinoma:role in vasculogenic mimicry［J］．Cancer Biol Ther，2008，7(5):758-766．

［7］Mei J，Gao Y，Zhang L，et al．VEGF-siRNA silencing induces apoptosis，inhibits proliferation and suppresses vasculogenic mimicry in osteosarcoma in vitro［J］．Exp Oncol，2008，30(1):29-34．