王 玨 閆 麗 曾翔俊 王紅霞 蘆玲巧 張立克

(1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理教研室，北京 100069;2.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院肝病研究所，北京 100069;3.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，北京 100069)

心臟保護(cardioprotection)是指防止與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)和再灌注(reperfusion)有關(guān)的損傷，上述損傷的主要臨床表現(xiàn)是心肌壞死、心律失常和心肌收縮功能障礙［1］。心臟保護機制的探討將為臨床防治再灌注損傷提供新的思路，故得到重視。近年研究［2］證實，內(nèi)源性生物活性物質(zhì)參與心臟保護作用，其中細胞色素P450表氧化酶/環(huán)-二十碳三烯酸(cytochromeP450 epoxygenases/epoxyeicosatrienoic acids，CYP450/EETs)系統(tǒng)的作用近期引起關(guān)注。研究表明，11，12-環(huán)氧二十碳三烯酸(11，12-epoxyeicosatrienoic acid，EETs)減少應激心肌細胞線粒體損傷［3］及缺血后心電圖異常［4］;CYP450亞型CYP2J2高表達及EETs的增加可以改善缺血再灌注心肌損傷［5］;缺血后處置通過上調(diào) CYP2J3及11，12-EET 保護心臟［6］;故外源性 11，12-EET 具有潛在的臨床應用前景。本課題組前期工作顯示，11，12-EET激活血小板一氧化氮/一氧化氮合酶(nitric oxide/nitric oxide synthase，NO/NOS)系統(tǒng)［7］;外源性 11，12-EET改善缺血再灌注損傷的同時，出現(xiàn)結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(structural nitric oxide synthase，sNOS)增加［8-9］及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(excelluar signal regulated kinase，ERK1/2)表達增加［10］;而 ERK1/2 抑制劑阻斷11，12-EET心臟保護作用［11］。鑒于NOS同功酶改變與 ERK1/2 磷酸化有關(guān)［12］，11，12-EET 引起的sNOS上調(diào)是否與ERK1/2改變有關(guān)值得探討。本實驗采用ERK1/2抑制劑PD098059，探討11，12-EET心臟保護中sNOS與ERK的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

11，12-EET(E5641，美國 Sigma公司);NOS測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);PD98059(P215，美國Sigma公司)。超速低溫離心機(3K30，美國Sigma公司);PC-lab生物信號采集系統(tǒng)(北京Pc-lab公司);DIAX900勻漿儀(德國Aeidolph公司)。

1.2 動物模型制備

體質(zhì)量200～300 g雄性Wistar大鼠，由首都醫(yī)科大學實驗動物部提供，動物合格證號 SCSK(京)200020012。對Wistar大鼠行戊巴比妥鈉(45 mg/kg，ip)麻醉，人工呼吸機維持正壓呼吸，在近主動脈根部結(jié)扎冠狀動脈左前肢60 min，松開30 min，復制缺血/再灌注心肌損傷模型。

1.3 實驗分組

動物分為4組，每組6只。① 缺血再灌注組(ischemia/reperfusion，I/R):給予上述同體積的0.9%氯化鈉注射液20 min后復制心肌缺血/再灌注損傷模型;② 假手術(shù)組(Sham):給予上述同體積的0.9%氯化鈉注射液后觀察110 min;③11，12-EET缺血再灌注組(EET+I/R)，給予 6.24 × 10-8mol/L 11，12-EET，20 min后復制心肌缺血/再灌注損傷模型;④11，12-EET缺血再灌注加PD098059組(EET+I/R+PD)，給予 PD098059(0.3 mg/kg)和 6.24 × 10-8mol/L 11，12-EET，20 min 后復制心肌缺血/再灌注損傷模型。上述各組大鼠均于實驗結(jié)束后取其心臟。

1.4 心功能檢測

經(jīng)頸總動脈逆行插管至左心室，遠端接壓力換能器后再經(jīng)PClab軟件輸入計算機，持續(xù)監(jiān)測左心室內(nèi)壓力的變化情況，并由計算機直接計算出收縮期左心室內(nèi)壓上升的最大變化速率(+dp/dt max)和舒張期左心室內(nèi)壓下降的最大變化速率(-dp/dt max)。以缺血前和再灌注30 min作為觀察點，各項指標均以實際觀察值/缺血前值(插管后穩(wěn)定5 min的正常值)×100%表示。

1.5 心肌組織NOS活性的測定

采用化學比色法測定大鼠心肌組織中NOS總量及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)含量。sNOS含量等于NOS總量與iNOS之差。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示。各組間計量資料的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠缺血/再灌注損傷心功能的變化

各組動物心肌再灌注30 min時+dp/dt max詳見圖1。方差分析結(jié)果為F=2 427.722，P=0.000 8。I/R組+dp/dt max低于Sham組及EET+I/R組(52.19% ± 4.22% 與 92.87% ± 4.53%，P=0.000 56;52.19% ±4.22% 與87.64% ± 4.85%，P=0.000 18);EET+I/R+PD 組(29.34% ± 21.03%)低于 EET+I/R 組(P=0.000 56)。

圖1 再灌注30 min大鼠心臟+dp/dt maxFig.1 The heart+dp/dtmax in rat ats reperfusion 30 min

動物心肌再灌注30 min時-dp/dt max詳見圖2。方差分析結(jié)果為F=747.18，P=0.000 11。I/R 組-dp/dt max低于Sham組及EET+I/R組(54.56% ±2.27%與 89.24% ± 7.48%，P=0.000 47;54.56% ±2.27%與 79.71% ±4.30%，P=0.000 19);EET+I/R+PD組低于 EET+I/R組(27.56% ±20.33% 與79.7% ±4.30%，P=0.000 78)。

圖2 再灌注30 min大鼠心臟-dp/dt maxFig.2 The heart-dp/dt max in rats at 30 min

2.2 大鼠缺血/再灌注損傷心肌NOS活性的檢測

動物心肌 sNOS詳見圖3。I/R組(0.292 1±0.074 7)U/mg低于 Sham 組(0.746 8 ±0.023 4)U/mg，P=0.000 23 及 EET+I/R 組(1.044 1 ±0.066 6)U/mg，P=0.000 11;EET+I/R 組高于 EET+I/R+PD 組(0.734 8 ±0.037 3)U/mg，P=0.000 10。

圖3 大鼠心臟結(jié)構(gòu)型NOS活性Fig.3 The activity of constrictive NOS in rat

3 討論

本研究組實驗證實11，12-EET引起的心臟自身保護作用中，ERK 激活［10］和 sNOS 活力改變［8］同時出現(xiàn)。兩者在心臟保護中是平行作用還是交互作用尚不清楚。

本實驗結(jié)果顯示，再灌注30 min I/R組±dp/dt max均低于Sham組，提示缺血/再灌注減弱心肌收縮和舒張性;給予11，12-EET再灌注30 min時±dp/dt max高于 I/R 組(P＜0.01)，提示11，12-EET具有拮抗缺血/再灌注對心臟的損害作用。I/R組心肌sNOS低于Sham組，提示心肌缺血/再灌注引起的心功能損傷與sNOS活力抑制有關(guān);EET+IR組sNOS高于I/R組(P＜0.01)，再灌注期心臟±dp/dt max也高于I/R組，說明11，12-EET通過增加sNOS活力改善心功能。

Wang H等［12］指出，EETs上調(diào)sNOS是通過激活絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)。本課題組前期工作也顯示 11，12-EET通過激活ERK1/ERK2介導心臟保護作用［10］。而本項研究表明，EET+I/R+PD組心肌sNOS低于EET+I/R組(P＜0.01)，提示ERK抑制劑也抑制11，12-EET引起的sNOS上調(diào)，揭示11，12-EET可能通過上調(diào)ERK進而上調(diào)sNOS。鑒于EET+I/R+PD組再灌注期心臟±dp/dt max低于EET+I/R 組(P＜0.01)，提示11，12-EET心功能保護作用可能通過上調(diào)ERK進而增加sNOS的表達。

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