王運(yùn)良 張玉鎮(zhèn) 耿同超 張曉席 曾志磊 韓 冰 尹紅蕾

1）解放軍第148醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 淄博 255300 2）清華大學(xué)玉泉醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 北京 100049 3）鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

多發(fā)性硬化（MS）是由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、抗體及補(bǔ)體介導(dǎo)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的炎癥脫髓鞘疾病。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子并激活CD4細(xì)胞啟動(dòng)炎癥反應(yīng)成為T輔助細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吸收細(xì)胞碎片、蛋白酶并釋放細(xì)胞因子，在脫髓鞘中起重要作用［1］。

殼多糖酶家族屬于18家族糖基水解酶，人類殼多糖酶的殼三糖苷酶（CCTS）在活化的巨噬細(xì)胞，尤其病理?xiàng)l件下長期表達(dá)。組織巨噬細(xì)胞表達(dá)高活性的CCTS，引起脂質(zhì)積聚，在溶酶體脂質(zhì)紊亂、地中海貧血、鐮刀狀貧血等病人的血液中，CCTS活性明顯升高［2］?；顒?dòng)性 MS病變的特點(diǎn)是血管周圍淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，由星型膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞趨化因子，誘導(dǎo)單核細(xì)胞從血液向腦組織遷移，并分化為巨噬細(xì)胞。斑塊中央早期損傷部位為巨噬細(xì)胞充填，在慢性活動(dòng)性MS時(shí)，細(xì)胞浸潤不明顯，僅限于斑塊周圍，充填脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞圍繞在缺少細(xì)胞的斑塊中央，提示浸潤的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，使CNS的CTTS活性增加和腦脊液（CSF）內(nèi)CTTS積聚［3］。我們研究的目的是探討MS病人CSF中CCTS活性，以及CTTS活性增高與炎癥或免疫活化的關(guān)系，為MS的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例收集 2004－01～2010－12我們?cè)诮夥跑姷?48醫(yī)院、清華大學(xué)玉泉醫(yī)院、鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科對(duì)診斷為MS的住院病人開展此項(xiàng)試驗(yàn)，排除缺少腰穿（LP）記錄、臨床資料不完整者，共178例病人入組。根據(jù) MS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合復(fù)發(fā)緩解型 MS（RRMS）120例，繼發(fā)進(jìn)展型MS（SPMS）32例，原發(fā)進(jìn)展型 MS（PPMS）26例。另外選擇40例其他神經(jīng)疾患（OND），和30非神經(jīng)疾患病人作為對(duì)照組。OND包括脊髓型頸椎病、B12缺乏、血管病、肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）、脊髓空洞、脊髓損傷等。對(duì)照組病人包括同時(shí)間內(nèi)在上述三所醫(yī)院腰穿檢查排除神經(jīng)疾病者，包括頭痛、良性顱內(nèi)壓增高、無明顯原因震顫、發(fā)作性感覺喪失、眼瞼下垂等，對(duì)其血清和CSF中CTTS活性及CSF單核細(xì)胞數(shù)（MNC）和鞘內(nèi)IgG產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 方法 所有入組病例在24h內(nèi)完成體檢、輔助檢查和生化檢查，靜脈穿刺收集血液標(biāo)本，室溫下離心5min（1500×g），取上清液分儲(chǔ)于－80℃ 冰箱備用。選擇第3～4腰椎間隙為穿刺點(diǎn)，穿刺成功后收集CSF，常規(guī)檢查后將CSF離心5 min（800×g），將上清液分裝于小試管內(nèi)，－80℃ 冰箱凍存?zhèn)溆谩４龢?biāo)本收集完成后進(jìn)行常規(guī)酶活性測(cè)和CSF及血清殼三糖苷酶檢查。簡述如下：將冰凍的CSF和血清標(biāo)本復(fù)溫，用4MU三乙酰殼三糖孵育2h，CTTS與三乙酰殼三糖形成4甲基傘形酮，加入過量甘氨酸緩沖液終止反應(yīng)。應(yīng)用CobasFara熒光定量分析儀（Roch公司，荷蘭）測(cè)定4甲基傘形酮含量，計(jì)算CTTS比率，CTTS比率除以Q白蛋白（CSF和血清白蛋白濃度的比例）來計(jì)算CTTS指數(shù)。CSF檢查的變化系數(shù)（CV）在10.6μmol／（h·L）（n＝10）活性時(shí)是3.8%，在4.88 μmol／（h·L）（n＝10）活性時(shí)為0.66%。血清化驗(yàn)檢查中的CV 在52.4μmol／（h·L）（n＝10）時(shí)為 1.54%，在 134.3 μmol／（h·L）（n＝10）時(shí)為1.55%。CSF化驗(yàn)檢查中CVs如下，5.0% （4.8μmol／（h·L），n＝3），血 清 2.2% （118.5 μmol／（h·L），n＝3）。CTTS活性不受性別影響。免疫印跡方法分析CSF和血清寡克隆IgG帶，比濁法測(cè)定白蛋白和IgG濃度（貝克曼圖像分析儀，荷蘭）。IgG指數(shù)＝（CSFIgG除以血清IgG）／（CSF白蛋白／血清白蛋白），以IgG指數(shù)＞0.58為升高。按照Reiber等的方法計(jì)算鞘內(nèi)Ig產(chǎn)物［4］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)程序軟件包完成統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)兩組間比較應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，其他應(yīng)用post－h(huán)oc檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)和CSF標(biāo)志物 RRMS、PPMS、SPMS組與OND組和對(duì)照組年齡無明顯差異。SPMS和PPMS組擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表（EDSS）評(píng)分高與OND組，而RRMS組不明顯。RRMS、PPMS和SPMS組與OND組病程類似。與OND組相比，RRMS、PPMS和SPMS組CSF單核細(xì)胞數(shù)增高。MS組病人76.5%～95%（全部 MS病人82.6%）CSF發(fā)現(xiàn)克隆IgG帶，而OND組為8.9%。MS病人IgG指數(shù)增高但與鞘內(nèi)IgG產(chǎn)物的比例降低（見表1）。

2.2 CTTS活性和CTTS指數(shù) MS病人血清CTTS活性與OND組相比無明顯不同，但CSF中CTTS活性明顯高于OND組（P＜0.001）。MS組CTTS指數(shù)也明顯高于OND組（P＜0.05）和對(duì)照組（P＜0.001）。在全部 MS病人，RRMS和SPMS組CTTS指數(shù)與OND和對(duì)照組明顯升高。按照對(duì)照組測(cè)定的數(shù)值，我們界定CTTS的參考上限（p95＝均數(shù)＋2×SD）為0.045，大部分 RRMS、SPMS和P PMS組病人CTTS指數(shù)均高于0.047（見表2）。

2.3 CTTS活性與CSF免疫活化及炎癥的關(guān)系 在RRMS組，CSF伴有MNC增高或寡克隆IgG帶病人的CTTS指數(shù)高于無MNC增高或寡克隆IgG帶病人，這種現(xiàn)象也見于整體MS組。在SPMS與PPMS病人，伴有CSF寡克隆IgG帶病人CTTS指數(shù)高于無寡克隆IgG帶病人，而MNC沒有這種關(guān)系（見表3）。

表1 臨床特點(diǎn)與炎癥或免疫活化的CSF標(biāo)志物比較

表2 CSF與血清CTTS活性和CTTS指數(shù) （）

表2 CSF與血清CTTS活性和CTTS指數(shù) （）

注：（1）RRMS和SPMS組與對(duì)照組比較，P＜0.05；（2）SPMS組與OND組比較，P＜0.05；（3）MS組與 OND組比較，P＜0.05；（4）MS組與對(duì)照組比較，P＜0.001

表3 CTTS指數(shù)與MNC、鞘內(nèi)IgG產(chǎn)物及寡克隆IgG帶 （）

表3 CTTS指數(shù)與MNC、鞘內(nèi)IgG產(chǎn)物及寡克隆IgG帶 （）

注：組內(nèi)比較，癎P＜0.05；組內(nèi)比較，▲P＜0.01；組內(nèi)比較，★P＜0.001

3 討論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在 MS病人，RRMS和SPMS病人CTTS指數(shù)增高，尤其是RRMS病人CTTS指數(shù)更高，認(rèn)為CCTS指數(shù)增高與鞘內(nèi)免疫活化或炎癥有關(guān)。人類的CTTS主要來自單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞家族，包括小膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞活化導(dǎo)致CTTS分泌增加。MS時(shí)巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥和吞噬作用，因此認(rèn)為CSF中CTTS活性增高可能是由于鞘內(nèi)炎癥反應(yīng)或吞噬作用引起。有研究報(bào)道，亞洲人群視神經(jīng)脊髓炎病人活化的CD4陽性T細(xì)胞產(chǎn)生白介素－17可引起中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化性，但僅限于MS的視神經(jīng)脊髓炎癥，而歐洲病人缺乏這種相關(guān)性［5］。

以往認(rèn)為，SPMS病人炎癥和免疫活化較RRMS少見，我們發(fā)現(xiàn)RRMS和SPMS病人與對(duì)照組相比CTTS指數(shù)增高，但在SPMS病人，CTTS指數(shù)增高僅限于CSF寡克隆IgG帶病人，在不伴有IgG指數(shù)增高或鞘內(nèi)產(chǎn)物的SPMS病人，盡管CSF內(nèi)MNC升高，CTTS沒有明顯增加。這種現(xiàn)象提示免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并非是SPMS病人CTTS活性增高的主要原因，說明SPMS病人的CSF病理學(xué)較RRMS更復(fù)雜，無論是MRI對(duì)比增強(qiáng)或免疫組織化學(xué)顯示炎癥證據(jù)不明顯，尸檢證實(shí)SPMS組織結(jié)構(gòu)紊亂主要是由于退行性變伴有軸突變性［6］。由此推斷，與RRMS相比，SPMS病人的CTTS指數(shù)增高，可能反應(yīng)有其他的病理過程參與，并非炎癥或吞噬作用等簡單的病理過程。

最近歐洲的一項(xiàng)研究報(bào)道，MS病人CSF和血漿CTTS活性明顯增高，而且SPMS病人血液CTTS活性高于RRMS病人［7］。但我們研究發(fā)現(xiàn)MS病人血液CTTS活性不增高，SPMS病人與RRMS相比無明顯變化，PMS病人與RRMS相比CSF中CTTS活性輕度升高，但CTTS指數(shù)無明顯差別。部分原因可能是由于亞洲與歐洲人群之間不同的臨床特點(diǎn)造成的，也可能是由于歐洲人群特定的基因或免疫學(xué)特點(diǎn)與SPMS病人巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞活性增高有關(guān)，確切原因有待進(jìn)一步研究。另有文獻(xiàn)報(bào)道，歐洲撒丁島人群MS的發(fā)病機(jī)制與特定的人類白細(xì)胞抗原（HLA）等位基因有關(guān)，且不同HLA亞型的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子［8］。我們總共對(duì)178例MS病人，其中包括26例PPMS病人進(jìn)行研究，而它們的研究為22例MS病人，僅包括2例PPMS病人，樣本數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于它們的研究報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)PPMS的CTTS指數(shù)沒有升高，提示PPMS病人的巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞活性較SPMS病人明顯降低。一般情況下，PPMS病人很少有頭顱MRI異常，常表現(xiàn)典型的脊髓縱向損害，脊髓損傷常導(dǎo)致殘疾，鄰近損害部位的蛛網(wǎng)膜下腔CSF檢查更易發(fā)現(xiàn)CTTS增高，但由于脊髓體積小，周圍損傷不明顯，這也是PPMS病人CTTS活性沒有增高的部分原因。

另外，我們發(fā)現(xiàn)82.6%的MS病人CSF出現(xiàn)寡克隆IgG區(qū)帶，鞘內(nèi)IgG產(chǎn)物為41.4%，63.5%病人IgG指數(shù)增高，低于其他文獻(xiàn)報(bào)道。由于我們的研究樣本來自三家不同的醫(yī)院，經(jīng)過臨床專家和MRI、CSF和誘發(fā)電位檢查，包括少數(shù)非典型或癥狀和體征不明顯得到確診的MS病人，與來自單個(gè)醫(yī)院或某一地區(qū)其他的報(bào)道可能有某些區(qū)別。因此，我們的研究發(fā)現(xiàn)RRMS和SPMS病人CSF的CTTS指數(shù)增高，這種增高與CSF的炎癥及免疫活化有關(guān)，但其確切機(jī)制需要獨(dú)立的相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)。

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