程小媛

江蘇常州市腫瘤醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 常州 213001

腦血管病是危害人類健康和生命最常見的疾病之一。血管內(nèi)皮位于血管的最內(nèi)層，直接與循環(huán)血液接觸，較易受到血液中的活性物質(zhì)及血液的剪切力的影響。在許多病理情況下，如腦缺血再灌注導(dǎo)致機體產(chǎn)生大量的氧自由基，而內(nèi)源性清除自由基能力下降，使機體的氧化－抗氧化機制失衡而導(dǎo)致細胞死亡。近來研究表明促紅細胞生成素作為一個新的神經(jīng)保護因子，其神經(jīng)保護作用已成為新的研究熱點。外源性EPO能減輕局灶性腦缺血、腦外傷、腦炎及脊髓損傷等動物模型的神經(jīng)細胞損傷，但國內(nèi)外相關(guān)報告多集中于對神經(jīng)元的保護研究。我們采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞建立過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞氧化損傷模型，觀察重組人促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）對氧化損傷血管內(nèi)皮的保護作用，闡述rhEPO對血管內(nèi)皮細胞的保護機制。

1 材料

1.1 藥品和試劑 重組人促紅細胞生成素（rhEPO）購自沈陽三生制藥公司，Annexin V－FITC細胞檢測凋亡試劑盒購自晶美生物技術(shù)公司，1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、4－甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Sigma公司，MDA和SOD試劑盒購自南京建成研究所，H2O2購于天津市天釜化工有限公司。

1.2 細胞 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株。

2 方法

2.1 內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）解凍復(fù)蘇，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。至細胞融合至80%，用0.25%的胰酶消化，傳代后接種于培養(yǎng)瓶和孔板中，待細胞融合至70%用于實驗。

2.2 實驗分組 （1）正常對照組：在培養(yǎng)液中孵育24h。（2）H2O2損傷組：參考 Haendeler J等［1］H2O2損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞模型，在培養(yǎng)液中孵育12h后，加入含H2O2的培養(yǎng)基（終濃度0.1mmol／L）繼續(xù)孵育12h。（3）藥物干預(yù)組：在含rhEPO（rhEPO濃度為1.25U／mL，2.50U／mL，5.00U／mL，10.00U／mL，20.00U／mL）培養(yǎng)液孵育12h，加入含H2O2培養(yǎng)液（終濃度0.1mmol／L）繼續(xù)孵育12h。

2.3 細胞增殖抑制實驗 取對數(shù)生長期的細胞制成2×104／mL細胞懸液，接種96孔板，每孔200μL，分組處理，每組設(shè)6復(fù)孔。待24h，細胞融合70%～80%按上述分組處理細胞。待實驗終止。更換培養(yǎng)基每孔200μL每孔MTT 20 μL，4h后棄去培養(yǎng)基，加入150μL二甲基亞藍，震蕩15 min，待結(jié)晶溶解后在酶標儀上測定570nm波長處的吸光度值（A570），實驗重復(fù)3次.

2.4 丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）活力的測定 細胞接種于六孔板上，培養(yǎng)方法同前，將培養(yǎng)上清收集于離心管中，避光，800r／min離心5min，將上清移入2 mLEP管中，標記，－20℃避光保存。待所有標本收集齊后，按照MDA，SOD測試盒說明書測定。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取生長良好的細胞制成細胞懸液接種于6孔板中，細胞分組正常對照組、H2O2損傷組同上，rhEPO 干預(yù)組：（rhEPO 濃度 分 別 為5.00U／mL，10.00U／mL）。實驗完成后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制成單細胞懸液，800r／min，4℃離心10min，棄上清液。加入1mL冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，800r／min，4℃離心10min，棄上清液，重復(fù)一次。將細胞重懸浮于200μL結(jié)合緩沖液，加入5μL Annexin V－FITC和10μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min，加入400μL結(jié)合緩沖液，立即上機檢測，實驗重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件包分析，t檢驗進行組內(nèi)和組間差異顯著性分析。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MTT法觀察rhEPO干預(yù)組對H2O2損傷的保護作用本實驗結(jié)果見圖1，血管內(nèi)皮細胞被0.1mmol／LH2O2損傷后，細胞活性下降，細胞A值較正常對照組明顯下降（P＜0.01）。而rhEPO預(yù)處理各組，細胞A值較H2O2損傷組增高（P＜0.05），細胞活性增高，且呈劑量依賴，隨rhEPO濃度增高而增高（見圖1）。

圖1 各實驗組血管內(nèi)皮細胞活力測定

3.2 細胞上清的 MDA，SOD的測定 表1示：H2O2損傷組的MDA值高于其他各組（P＜0.01）SOD值低于其他各組（P＜0.01），rhEPO預(yù)處理各組 MDA值低于 H2O2損傷組（P＜0.01），SOD值高于 H2O2損傷組（P＜0.01）。而1.25 U／mL rhEPO干預(yù)組與2.50U／mL rhEPO干預(yù)組 MDA，SOD相比無差異（P＞0.05），余各rhEPO預(yù)處理組間MDA，SOD值相比較（P＜0.01），且MDA值隨rhEPO干預(yù)濃度增高而降低，SOD值隨rhEPO干預(yù)濃度而增高，呈劑量依賴。

表1 各實驗組細胞上清MDA含量和SOD活力的測定 （）

表1 各實驗組細胞上清MDA含量和SOD活力的測定 （）

注：與正常對照組比較，＃P＜0.01；與 H2O2 損傷組組比較，★P＜0.01

3.3 流式細胞檢測細胞凋亡 正常對照組的細胞凋亡率為（0.6±0.39）%，H2O2損傷的模型細胞凋亡率明顯增高為（44.3±2.13）%（P＜0.01）。而rhEPO干預(yù)組細胞的凋亡率明顯減低，5.00U／mL rhEPO組細胞凋亡率為（22.6±1.24）%，而10.00U／mL rhEPO組細胞凋亡率降低為（11.7±1.01）% （P＜0.01）。

4 討論

促紅細胞生成素（EPO）由胚胎肝臟和成人腎臟分泌的一種低分子糖蛋白，長期以來作為一個調(diào)節(jié)血細胞生成的細胞因子。近來研究表明EPO并不局限于作為紅細胞的調(diào)節(jié)因子，還具有抗血管痙攣、抗凋亡和抗炎等多種功能［2］。EPO和EPO抗體不僅存在于造血系統(tǒng)中，還存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，并且低氧可以促進這兩種蛋白的表達［3］，提示EPO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性細胞因子。有研究表明大腦中動脈閉塞七天后，給予外源性rhEPO治療的老鼠較生理鹽水治療的老鼠相比較：缺血半暗帶區(qū)VEGF（內(nèi)皮生長因子）增加了52%，說明了EPO促進了腦梗死后的血管再生［4］。急性大腦皮層缺血損傷時，腦血管內(nèi)皮細胞EPO受體表達增加 ，提示EPO可能具有保護內(nèi)皮的作用，EPO可阻止低氧誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮損傷［5－6］。

在實驗中，我們選擇外源性H2O2作為損傷劑，發(fā)現(xiàn)在細胞損傷過程中，H2O2損傷組 MDA明顯升高，SOD活性明顯下降。MDA是細胞氧化損傷的產(chǎn)物，MDA可與蛋白，核酸交聯(lián)，造成細胞的進一步損傷，SOD是機體抗氧化防御機制的重要，可催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫和分子氧，SOD活力的高低反映機體清除自由基的能力，兩者是反應(yīng)氧自由基生成及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的指標。說明H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡機制可能是H2O2使內(nèi)皮細胞氧化和抗氧化機制失衡，發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。rhEPO預(yù)處理組較H2O2損傷組可以減少血管內(nèi)皮細胞的MDA的產(chǎn)生和使SOD活力升高，并且有劑量依賴，高濃度rhEPO使MDA減少的更明顯和SOD活力升高更明顯。rhEPO可以減少脂質(zhì)過氧化物形成，提高機體抗氧化能力，rhEPO預(yù)處理組可以提高細胞活性和抑制過氧化氫誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的凋亡，其作用機制可能是抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

rhEPO目前主要用于治療貧血，臨床運用廣泛，且已有臨床實驗表明患者在出現(xiàn)腦卒中癥狀的8h內(nèi)靜脈使用rhEPO，顯著改善治療結(jié)果［7］，rhEPO在腦血管病中的作用有待深入的實驗研究闡明其作用機制，以及大樣本臨床研究證實其有效性和安全性。

［1］Haendeler J，Popp R，Goy C，et al.Cathepsin D and H2O2stimulate degradation of thioredoxin－1：implication for endothelial cell apoptosis［J］.Biol Chem，2005，280（52）：42945－42951.

［2］Erbayraktar S，Yilmaz O，Gokmen N，et al.Erythropoietin is a multifunctional tissue－protective cytokine［J］.Hematol Rep，2003，2（6）：465－470.

［3］Bernaudin M，Nedelec AS，Divoux D，et al.Normobaric hypoxia induces tolerance to foca1permanent cerebra1ischemia in associationwith an increased expression of hypoxia－inducible factor－1and itstarget genes，erythropoietin and VEGF，in the adult mouse brain［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（4）：393－403.

［4］Wang L，Zhang Z，Wang Y，et al.Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats.［J］.Stroke，2004，35（7）：1732－1737.

［5］Siren AL，Knerlich F，PoserW，et al.Erythropoietin and erythropoietin receptor in human ischemic／hypoxicb rain［J］.Acta Neuropathol，2001，101（5）：271－276.

［6］Chong ZZ，KangJ，Maiese K，et al.Erythropoietin is a novel vascular protectant through activation of Aktl and mitochondrial modulation of cysteine proteases［J］.Circulation，2002，106（24）：2973－2979.

［7］Ehrenreich H，Hasselblatt M ，Dembowski C，et al.Erythropoi etin therapy for acute stroke is both safe and beneficial［J］.Mol Med，2002，8（8）：495－505.