曹金霞 耿德勤 姜建東 劉 莉 姜玉龍 孫德錦

1）江蘇連云港第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 連云港 222002 2）徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 徐州 221002

腦卒中后抑郁癥（post－stroke depression，PSD）是腦卒中最常見的并發(fā)癥之一，分析顯示占腦卒中患者30%左右，常直接影響患者的生活質(zhì)量和神經(jīng)功能康復(fù)［1－2］。PSD的發(fā)生與中樞5－HT能系統(tǒng)功能障礙關(guān)系密切，位于突觸前膜的5－HT轉(zhuǎn)運體（5－HTT）通過再攝取突觸間隙的5－HT而在5－HT代謝及功能精細(xì)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，其編碼基因SCL6A4是抑郁癥分子遺傳研究的焦點［3－6］?，F(xiàn)在已知的眾多5－HTT基因多態(tài)性中，絕大多數(shù)多態(tài)性對5－HTT基因的結(jié)構(gòu)和功能表達(dá)沒有影響，5－HTT基因5’端啟動子區(qū)域上的5－HTTLPR多態(tài)性，是一個44個堿基的插入／缺失多態(tài)性，是5－HTT基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要位點［7］，5－HTTLPR多態(tài)性和抑郁癥的關(guān)系已被國內(nèi)外大量研究證實［6］，國外有研究顯示5－HTTLPR多態(tài)性與PSD關(guān)聯(lián)［3－5］，但是目前國內(nèi)有關(guān)于PSD與5－HTT基因多態(tài)性的研究非常少［9－10］，如果能找到5－HTT基因多態(tài)性和PSD有很好的相關(guān)性，那么就可以指導(dǎo)臨床。本研究采用病例－對照研究及關(guān)聯(lián)分析的方法，在江蘇漢族人群中探討5－HTTLPR多態(tài)性與PSD的關(guān)系，尋找PSD發(fā)病的遺傳易患因素。

1 對象與方法

1.1 對象 系2006－01～2011－06在徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和連云港市第二人民醫(yī)院神經(jīng)科住院漢族首次發(fā)病的腦卒中患者387例，均符合全國第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT或MRI確診。入組者均無意識障礙及智能障礙，既往無精神病史。其中符合中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版（CCMD－3）“抑郁癥”診斷標(biāo)準(zhǔn)及入院后第2周、第4周漢密爾頓抑郁量表（HAMD）17項評分＞17分，并持續(xù)2周以上者96例歸入PSD組，男39例，女57例；年齡39～70歲，平均（56.9±7.9）歲；腦梗死79例，腦出血17例。291例非PSD患者中隨機選擇97例歸入非PSD對照組，男43例，女54例；年齡40～65歲，平均（55.2±6.0）歲；腦梗死77例，腦出血20例。同時選擇徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢者共60例作為正常對照組，男24例，女36例；年齡40～65歲，平均（46.7±5.5）歲。對照組性別、年齡與PSD組相匹配。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提?。撼槿∪虢M者外周靜脈血5mL，EDTA抗凝，采用常規(guī)方法提取DNA（根據(jù)TIAN－GEN生化科技（上海）有限公司提供的DNA提取試劑盒說明進行）。

1.2.2 5－HTTLPR多態(tài)性檢測：采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，引物設(shè)計通過引物設(shè)計軟件primer 5.0及參考文獻(xiàn)進行，將通過軟件設(shè)計得到的多對引物輸入到美國國立圖書館數(shù)據(jù)庫的BLAST中（網(wǎng)址：www.ncbi.nlm.nih.gov／blast）進行引物的同源性比較，選出同源性最小而退火溫度（Tm值）合適的引物確定為PCR反應(yīng)引物，通過大連寶生物有限公司合成。上游引物為5′－GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC－3′，下游引物為5′－GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC－3′。PCR反應(yīng)體系25μL，dNTPs 200μmol／L，上、下游引物各10pmol／μL，10倍GC緩沖液8μL，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA 100ng。反應(yīng)在PCR擴增儀PT－100型進行。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，72℃延伸5min。產(chǎn)物檢測用2%瓊脂糖凝膠，80V電壓電泳60min，溴酚藍(lán)染色后用凝膠成像儀照相觀察電泳帶型確定基因型。目的基因的片段長度：S：484bp，L：528bp。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗或Mann－Whitney U檢驗，多組間比較用方差分析或非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料用頻數(shù)或百分位數(shù)表示，吻合度χ2檢驗用于檢驗各組是否符合Hardy－Weinberg（H－W）平衡法則；χ2檢驗用于比較各組間基因型和等位基因頻率的分布，等位基因與PSD的關(guān)系采用比值比（OR）估計相對危險度。

2 結(jié)果

2.1 基因型 本研究檢測到5－HTTLPR基因多態(tài)性的2種等位基因（見圖1）：S等位基因（484bp）、L等位基因（528 bp），3種基因型：SS、LS和LL型。未見到文獻(xiàn)中曾報道的超長L等位基因（572bp或616bp）。

2.2 Hardy－Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗（H－W 平衡）各組基因型均滿足 H－W 平衡（PSD組：χ2＝1.46，P＝0.22；非PSD組：χ2＝0.65，P＝0.42；正常對照組：χ2＝0.93，P＝0.34），表明本實驗所測基因型數(shù)據(jù)可靠，能代表各群體水平。

2.3 各組5－HTTLPR基因型和等位基因頻率比較 見表1。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示PSD組和腦卒中后非PSD組以及健康對照組間5－HTTLPR基因型頻率（SS、SL、LL）有顯著差異（χ2＝10.05，P＝0.04），PSD組SS基因型頻率（54.2%）及S等位基因頻率（71.9%）顯著高于腦卒中非PSD組（37.1%，59.3%）和健康對照組（33.1%，55.0%），攜帶 S等位基因者PSD的危險較對照組提高了1.76倍（OR＝1.76，P＜0.01，95%CI：1.15～2.69）。

圖15 －HTTLPR多態(tài)位點PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 各組5－HTTLPR基因型及等位基因頻率的比較 ［例（%）］

3 討論

腦卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）的發(fā)病機制復(fù)雜，近幾十年研究并未得出肯定性的結(jié)論［1－2］。有研究［1，8］發(fā)現(xiàn)抑郁病史及抑郁癥家族史是PSD發(fā)生主要預(yù)測因素之一，提示PSD存在遺傳易感性，尋找PSD的易感基因成為研究的一個重點［3－5］。5－羥色胺重攝取抑制劑（SSRIs）有效治療PSD，提示PSD也與腦內(nèi)的5－HT代謝失衡有關(guān)。5－HT轉(zhuǎn)運體（5－HTT）是SSRIs類藥物作用靶點，也是5－HT代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，5－HTT功能受5－HTT基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，5－HTT基因也是PSD遺傳學(xué)研究的焦點。5－HTT基因5’端啟動子區(qū)域上的5－HTTLPR多態(tài)性，是5－HTT基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要位點［7］，在基因表達(dá)水平上影響5－HTT的轉(zhuǎn)運功能，因而有理由認(rèn)為5－HTTLPR多態(tài)性和PSD可能存在相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示PSD組5－HTT基因的5－HTTLPR多態(tài)性SS基因型頻率及S等位基因頻率顯著高于腦卒中非PSD組和健康對照組，攜帶S等位基因者PSD的危險性提高了1.76倍（OR＝1.76，P＜0.01）。提示5－HTTLPR多態(tài)性可能與中國漢族PSD的發(fā)病存在一定相關(guān)性，SS基因型及S等位基因是中國漢族PSD的危險因子。歐美人群［3－5］和國內(nèi)［9］研究也提示5－HTTLPR多態(tài)性與PSD的發(fā)病相關(guān)，支持本實驗結(jié)果。

根據(jù)啟動子區(qū)5－HTTLPR多態(tài)性將5－HTT基因分為L／L、L／S、S／S3個基因型。在蛋白產(chǎn)物水平上，LL基因型產(chǎn)物的重攝取5－HT能力分別是LS基因型產(chǎn)物、SS基因型產(chǎn)物的1.9倍和2.2倍，“L”等位基因能增強5－HTT基因的轉(zhuǎn)錄和5－HTT蛋白的表達(dá)，從而使5－HT的回吸收率升高，因而認(rèn)為“L”與“S”在5－HTT基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運體蛋白的表達(dá)上有不同的功能，從而影響5－HT的生理功能［7］。但5－HTTLPR究竟具體是通過何種途徑來影響5－HTT功能，目前還不清楚，尚需進一步的研究。盡管結(jié)論尚不一致，大量研究支持S型等位基因與應(yīng)激事件后發(fā)生抑郁風(fēng)險相關(guān)，SS基因型與應(yīng)激事件相互作用導(dǎo)致抑郁的發(fā)生［6］。

本研究初步探索5－HTTLPR多態(tài)性與PSD的關(guān)系，為以后繼續(xù)進一步研究奠定了基礎(chǔ)。盡管本次研究發(fā)現(xiàn)5－HTTLPR多態(tài)性與中國漢族PSD之間可能存在一定關(guān)聯(lián)，但本研究僅涉及多個多態(tài)位點中重要的一個，其他位點以及各位點間的相互作用對PSD的影響尚未研究。本研究的樣本量較少，并且缺乏家系資料，未能進行傳遞平衡檢驗，因此更需要在相同或不同人種和地理環(huán)境背景下的其他或更大的獨立患者樣本及家系中進行謹(jǐn)慎的重復(fù)性試驗來驗證5－HTTLPR多態(tài)性與PSD的關(guān)系。

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