祁巖超 劉振寰 柴鐵劬 唐純志

1)廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院(廣州醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所) 廣州 510095 2)廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬南海婦產(chǎn)兒童醫(yī)院 南海 528200 3)廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 廣州 510405

細(xì)胞凋亡,又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)。研究已經(jīng)證實(shí),在腦組織缺血缺氧(hypoxicischemic brain damage,HIBD)時除缺血區(qū)神經(jīng)元的壞死外還存在某些易損區(qū)內(nèi)神經(jīng)元選擇性細(xì)胞凋亡,故在防治HIBD時,阻止細(xì)胞死亡,還是抑制細(xì)胞凋亡,均具有重要的治療意義。各種圍產(chǎn)期因素引起的HIBD,是導(dǎo)致兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘,引起腦性癱瘓的常見原因之一。由于HIBD導(dǎo)致腦血流減少和腦組織生化代謝改變,引起腦組織一系列病理改變,如皮質(zhì)梗死,丘腦、基底節(jié)和間腦等部位深部灰質(zhì)壞死,腦干壞死,腦室周圍或腦室內(nèi)出血以及腦白質(zhì)病變等。本實(shí)驗(yàn)?zāi)MHIBD的病理改變,通過針刺的早期及超早期干預(yù),觀察針刺對新生幼鼠 HIBD腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用,探討針刺對腦癱的早期康復(fù)的可行性及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物選擇 7 d齡新生SD幼鼠85只(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,清潔級),雌雄各半,體質(zhì)量11.5～18.4 g,平均(12.6±2.1)g,鼠飼養(yǎng)環(huán)境:清潔級動物實(shí)驗(yàn)室,溫度22～26℃,相對濕度60%～80%,日光燈照射,定時通風(fēng)換氣,常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。造模前翻身、平衡、爬行功能測定均無異常。

1.2 模型制作和分組方法 模型制作參照文獻(xiàn)[2]并加以改進(jìn);將成功的模型動物隨機(jī)分為3組:A組:HIBD+針刺Ⅰ組,B組:HIBD+針刺Ⅱ組,C組:HIBD組;另設(shè)假手術(shù)組D組,每組24只。

1.3 針刺處理和針刺方法 取穴,定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3],HIBD+針刺I組手術(shù)后24 h開始針刺,前7 d僅針?biāo)闹垦ㄎ?第8天開始加針頭部穴位。HIBD+針刺Ⅱ組手術(shù)后第8天開始針刺,頭、體針同步。具體針刺方法同“針刺對幼鼠HIBD腦組織發(fā)育及NGF蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究”[4]。

1.4 觀察指標(biāo) (1)海馬錐體層CA1區(qū)錐體神經(jīng)元個數(shù):實(shí)驗(yàn)動物于缺血缺氧后21 d處死、取腦,觀察腦的大體變化;雙側(cè)腦組織分別稱質(zhì)量;稱取腦質(zhì)量的腦組織,經(jīng)中性甲醛固定后,按嘴側(cè)至尾側(cè)方向,從胼胝體膝至背側(cè)海馬作連續(xù)冠狀切片,片厚50 μ m,對照Paxinos和 Watson圖譜,確定上述切片背側(cè)海馬錐體層CA1區(qū)的中心部分,取3張連續(xù)腦片,以目鏡網(wǎng)格測試系統(tǒng)在10×40倍下計數(shù)1 mm長度范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù),取其平均值。(2)海馬錐體層CA1區(qū)及左大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡個數(shù):細(xì)胞凋亡檢測采用T UNEL法,按檢測試劑盒購說明進(jìn)行(武漢博士德生物制品公司)。

1.5 細(xì)胞凋亡記數(shù)方法 用圖像分析儀在光鏡下計算每張腦片中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目。凋亡神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)方法:細(xì)胞核呈棕黃色者為陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。每張大鼠腦缺血部位切片隨機(jī)取10個視野,計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù),求其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包,計量資料以表示,率的比較采用 χ2檢驗(yàn),組間多均數(shù)比較采用方差分析(F-q檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1 腦大體檢查及質(zhì)量的改變 HIBD后21 d,D組腦大體觀察未見明顯改變,A、B、C組在左腦半球大部分呈程度不等的萎縮,各組左大腦質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中C＜B＜A＜D,4組動物右腦質(zhì)量差異不明顯。見表1。

2.2 海馬錐體層CA1區(qū)錐體神經(jīng)元計數(shù) 見表2。

2.3 海馬錐體層CA1區(qū)及大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡計數(shù)比較 見表3。

表1 腦質(zhì)量的改變 (,mg)

表1 腦質(zhì)量的改變 (,mg)

組 別 n 左大腦質(zhì)量 右大腦質(zhì)量HIBD+針刺I組 10 441.53±22.54 477.08±25.46 HIBD+針刺II組 10 411.53±20.91 471.12±24.54 HIBD組 10 345.75±21.02 470.5±30.86假手術(shù)組 10 473.16±13.54 474.2±29.37 F值 44.15 0.108 P值 ＜0.01 ＞0.05

表2 海馬錐體層CA1區(qū)錐體神經(jīng)元計數(shù)(,個/mm2)

表2 海馬錐體層CA1區(qū)錐體神經(jīng)元計數(shù)(,個/mm2)

組 別 n 左 右HIBD+針刺I組 10 106.37±10.46 140.34±20.51 HIBD+針刺II組 10 95.09±17.86 142.18±18.07 HIBD組 10 76.38±15.84 144.27±21.54假手術(shù)組 10 145.45±15.6 148.19±20.12 F值34.68 0.164 P值 ＜0.01 ＞0.05

如表2所示,4組右側(cè)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),左側(cè)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),其中C＜B＜A＜D。

表3 海馬錐體層CA1區(qū)及大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡計數(shù) (,個/高倍視野)

表3 海馬錐體層CA1區(qū)及大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡計數(shù) (,個/高倍視野)

組 別 n 左 右HIBD+針刺I組 10 5.04±1.21 4.86±1.15 HIBD+針刺II組 10 6.50±1.01 5.09±1.06 HIBD組 10 23.41±4.37 12.15±3.72假手術(shù)組 10 3.18±1.35 3.26±1.13

如表3所示,4組左側(cè)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元凋亡數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中D＜A＜B＜C,左側(cè)大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡個數(shù)D＜A＜B＜C(P＜0.05)。

3 討論

由于腦性癱瘓發(fā)病原因、病變機(jī)制以及臨床癥狀都復(fù)雜多樣,缺血缺氧是許多腦癱腦損傷發(fā)生過程中所經(jīng)歷的重要病理環(huán)節(jié),因此,本研究在借鑒國內(nèi)外經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上,建立了新生乳鼠HIBD窒息腦癱模型,開展針刺治療HIBD的有關(guān)機(jī)制研究。

本研究參照Rice的方法利用結(jié)扎頸動脈和缺氧制成缺血缺氧性腦病的動物模型[2]的方法,復(fù)制了該模型,通過行為測試觀察到其感覺和運(yùn)動功能均存在一定障礙,至21 d時造模動物左腦大部分出現(xiàn)不同程度的萎縮,表明已成功建立了缺血缺氧性腦癱模型。

目前研究細(xì)胞凋亡的方法較多,最常用的特異性檢測凋亡細(xì)胞的方法為細(xì)胞原位標(biāo)記法,亦為 TUNEL法,其基本原理是TdT可特異結(jié)合帶3’-OH的核苷酸片段,并形成由dUTP-biotin組成的脫氧核昔酸多聚體,后經(jīng)帶有過氧化物酶的抗bi-otin抗體標(biāo)記,經(jīng)染色,陽性者提示細(xì)胞凋亡存在。

吳至鳳等[5]采用結(jié)扎孕鼠雙側(cè)子宮動脈,完全阻斷血供25min娩出胎鼠,制成腦損傷模型,將成功模型分為針刺組和模型組,每組8只,正常組剖宮取出胎鼠8只。正常組和模型組不予治療,針刺組于出生后7～30 d行針刺治療。30 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭取腦,用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,SABC法檢測腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果表明,針刺可以減少腦損傷大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,提高Bcl-2蛋白的表達(dá),降低Bax蛋白的表達(dá)。提示針刺具有抗局灶性腦缺血時腦細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)MHIBD病理改變,通過針刺百會、患側(cè)顳Ⅰ針、內(nèi)關(guān)、曲池、足三里、涌泉穴,觀察針刺對 HIBD神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響情況。結(jié)果在假手術(shù)組,大鼠腦內(nèi)僅見少量TUNEL染色陽性細(xì)胞(圖 1、2);在 HIBD幼鼠腦缺血缺氧后,大腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)可見大量的 TUNEL染色陽性細(xì)胞(圖3、4);在HIBD+電針Ⅰ組及 HIBD+電針Ⅱ組,大腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)TUNEL染色陽性細(xì)胞顯著減少(圖5～8),與HIBD組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。且缺血+電針Ⅰ組神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯少于缺血+電針Ⅱ組,2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示針刺可抑制HIBD后腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,對HIBD具有一定的保護(hù)作用,且越早干預(yù)效果越好。這可能與針刺阻止HIBD后脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng),從而抑制凋亡基因的啟動和促進(jìn)抗凋亡基因的產(chǎn)生,達(dá)到抗凋亡的目的。

[1]張?zhí)K明,方恩羽.缺血神經(jīng)元分子生物學(xué)研究的現(xiàn)狀與展望[J].中華神經(jīng)科雜志,1997,30(4):251-253.

[2]Rice.The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J].Annals of Neurology,1981,9(2):131.

[3]李忠仁,主編.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:329.

[4]祁巖超,劉淑華,劉振寰,等.針刺對幼鼠 HIBD腦組織發(fā)育NGF蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2008,11(12):1-4.

[5]吳至鳳,溫恩懿,趙聰敏,等.針刺對發(fā)育期腦損傷大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2010,39(21):2898-2903.