李紅光 田艷生 王江勇 張衛(wèi)

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，研究表明，一些體內(nèi)有結(jié)核分枝支菌L型(MTB-L)存在的非活動(dòng)性結(jié)核病患者的疾病具有潛在活動(dòng)性，并有復(fù)發(fā)的可能［1］，且有可能將其DNA整合到體細(xì)胞染色體上，激活原癌基因、抑制抑癌基因或引起細(xì)胞遺傳特性的改變而致癌［2］。為此，我們以結(jié)核病和肺癌患者為研究對(duì)象，用MTB-L培養(yǎng)和TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)(TaqMan-PCR)技術(shù)對(duì)其血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其臨床應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年5月至2010年5月我院門診及住院患者222例，分為2組:(1)結(jié)核病組:112例，根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征、胸部X線、CT、病理、實(shí)驗(yàn)室檢查等確診。其中男73例，女39例;年齡13～64歲，平均年齡42歲。肺結(jié)核101例(據(jù)1998年中國(guó)結(jié)核病分類法，其中血行播散肺結(jié)核5例，繼發(fā)性肺結(jié)核68例，結(jié)核性胸膜炎28例)，淋巴結(jié)核6例，結(jié)核性腦膜炎3例，睪丸結(jié)核2例。(2)肺癌組:110例，經(jīng)胸部X線、CT、病理、實(shí)驗(yàn)室檢查等確診。其中男77例，女33例;年齡43～78歲，平均年齡61.2歲。鱗癌36例，腺癌59例，肺泡細(xì)胞癌8例，低分化癌5例，支氣管黏液腺癌3例。2組一般資料具有均衡性。所有患者均采血2 ml×2(滅菌 EDTA-Na2抗凝管)。

1.2 方法 (1)溶血離心培養(yǎng)法［3］:取抗凝血 0.5～1.0 ml加入溶血管，溶血后3000 r/m水平離心30 min，取沉淀0.15 ml接種于92-3TBL液體培養(yǎng)基，混勻后置37℃培養(yǎng)1～3周，每周觀察1次，取沉淀物涂片進(jìn)行IK抗酸染色鏡檢，陽(yáng)性者移種至92-3TB液體培養(yǎng)基傳代(傳至第5代)返祖，并同時(shí)接種PNBMTB-L、TCH-MTB-L液體培養(yǎng)基鑒定分型。(2)TaqMan-PCR檢測(cè):全血 DNA 提取(SDS 溶血法［4，5］):取全血 200 μl，加入 10%SDS 20 μl，混勻，室溫放置 10 min，加入雙蒸水 3 ml，混合，10000 r/m，離心10 min，沉淀部分用雙蒸水洗2次。去上清液后，沉淀中加入50 μl TB-DNA提取液，震蕩混勻后，100℃沸水浴10 min，15000 r/m，離心10 min，取沉淀部分備用。取沉淀7 μl加入反應(yīng)管(TB PCR 緩沖液 30 μl，MgCl 25 μl，熒光探針5 μl，Taq 酶3 μl)中，低速離心數(shù)秒，取出置全自動(dòng)定量 PCR 儀上(PE5700擴(kuò)增儀，美國(guó) PE 公司)，50℃ 2 min，94℃ 5 min，93℃ 45 s，60℃ 129 s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后利用熒光定量PCR軟件分析:調(diào)節(jié)基線至適宜處，各擴(kuò)增曲線與閾值線的交叉點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上濃度與Ct值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可求出各待測(cè)標(biāo)本的初始濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較 溶血離心培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)核病組、肺癌組的MTB-L陽(yáng)性率分別為25%和40%，二者陽(yáng)性率結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TaqMan-PCR法檢測(cè)上述2組陽(yáng)性率分別為77.7%和75.5%，二者陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)核病組、肺癌組的兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩種方法檢測(cè)血液中MTB-L結(jié)果 例

2.2 MTB-L鑒定分型 結(jié)核病組中培養(yǎng)出的28株MTB-L經(jīng)鑒定分型:人型結(jié)核分支桿菌23株，牛型結(jié)核分支桿菌5株，經(jīng)傳代返祖，恢復(fù)典型原菌者16株，污染4株。肺癌組中培養(yǎng)出的44株MTB-L經(jīng)鑒定:人型結(jié)核分支桿菌36株，牛型結(jié)核分支桿菌7株，恢復(fù)典型原菌者21株，污染3株。

3 討論

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，居各種惡性腫瘤的首位。有的學(xué)者注意到:MTB可在抗生素、抗體、補(bǔ)體、溶菌酶等體內(nèi)外多種因素作用下導(dǎo)致細(xì)胞壁部分或完全缺陷形成MTBL，其小的原生質(zhì)體和濾過(guò)相與病毒的一些生物學(xué)特性相似，因此，MTB-L感染與肺癌的發(fā)生可能存在一定的關(guān)系。已從各種肺癌標(biāo)本中分離培養(yǎng)、檢測(cè)出MTB-L，進(jìn)一步證實(shí)MTB-L可進(jìn)入肺癌腫瘤細(xì)胞特別是細(xì)胞核內(nèi)，引起細(xì)胞的惡變［1］。我們從肺癌患者的血液中獲得較高的MTB-L檢出率，應(yīng)進(jìn)一步從分子生物學(xué)、遺傳學(xué)角度證實(shí)MTB-L與肺癌的關(guān)系，為肺癌的發(fā)病機(jī)制研究開(kāi)辟一個(gè)新的領(lǐng)域。

我們采用的溶血離心培養(yǎng)法獲得較高的陽(yáng)性檢出率(結(jié)核病組25.0%，肺癌組40.0%)，因紅細(xì)胞可黏附血液中大量的MTB-L，經(jīng)低滲裂解后，紅細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)的MTB-L釋放出來(lái)，經(jīng)離心濃縮，檢出率大為提高，方法簡(jiǎn)便易行。但此法觀察結(jié)果較為困難:MTB-L缺壁程度不一，形態(tài)和染色多變，不易將其與一些具有抗酸性的細(xì)菌及多種非微生物結(jié)構(gòu)(如各種染料沉渣等)區(qū)別開(kāi)來(lái)。肺癌組培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出率均明顯高于結(jié)核病組，考慮為肺結(jié)核組患者多處治療階段，MTB-L數(shù)量較少，且藥物等因素不利于培養(yǎng)檢出，而肺癌患者免疫力低下利于MTB-L生長(zhǎng)、又無(wú)抗癆藥物的抑制，所以檢出率較高。

我們將血液標(biāo)本溶血離心后接種92-3TBL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，簡(jiǎn)便易行，但取生長(zhǎng)沉淀物IK抗酸染色觀察結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，有些標(biāo)本著色不佳，出現(xiàn)“鬼臉”現(xiàn)象，有的標(biāo)本菌量較少，不易觀察，我們將液體培養(yǎng)物離心3000 r/m離心30 min后，IK抗酸染色延長(zhǎng)至48～72 h，獲得滿意的結(jié)果。結(jié)核病組中28株MTB-L經(jīng)返祖，僅恢復(fù)典型原菌者16株，肺癌組中44株MTBL恢復(fù)典型原菌者21株，返祖成功率較低，是否有的MTB-L發(fā)生遺傳性改變或細(xì)胞壁缺陷較為嚴(yán)重，形成了穩(wěn)定型MTB-L，有待于進(jìn)一步研究。

MTB-L可進(jìn)入血流，并且在播散的過(guò)程中黏附于紅細(xì)胞表面，使其免疫黏附能力下降。所以從全血標(biāo)本中進(jìn)行MTBDNA檢測(cè)，較之血漿、血清、白細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本，更能說(shuō)明患者的感染狀況。MTB-L具有MTB的重復(fù)保守序列和一些特異性插入片段，常用于檢測(cè) MTB的MPB64、MTP40、38-Kda等蛋白基因片段，IS986、IS6110等插入片段均可用于檢測(cè)MTB-L。朱明利報(bào)道，在肺結(jié)核患者外周血中MTB-L的檢出率為58.82%。我們用TaqMan-PCR技術(shù)定量檢測(cè)肺癌、肺結(jié)核患者全血標(biāo)本中的MTB-L，更能為臨床提供可靠的依據(jù)。

1 Onwuamaegbu ME，Belcher RA，Soare C.Cell wall deficient bacteria as a cause of infections:a review of the clinical signficience.Int Med Res，2005，33:1-20.

2 田艷生，崔幸琨，郝彤，等.結(jié)核分枝桿菌L-型感染與肺癌發(fā)生的相關(guān)性研究.腫瘤，2009，29:1085-1089.

3 中華結(jié)核和呼吸雜志編輯委員會(huì).結(jié)核分支桿菌L型的檢測(cè)方法(試行).中華結(jié)核和呼吸雜志，2003，2:67-69.

4 Rafi W，Venkataswamy MM，Ravi V，et al.Rapid diagnosis of tuberculous meningitis:a comparative evaluation of in-house PCR assays involving three mycobacterial DNA sequences，IS6110，MPB-64 and 65 kDa antigen.J Neurol Sci，2007，252:163-168.

5 Teruyuki T，Tomohiro NA.Novel technique of quantitative nested realtime PCR Assay for mycobacterium tuberculosis DNA.J Clin Microbiol，2006，44:1029-1039.