孟津 金海紅 姜麗 陳燕

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是育齡女性常見(jiàn)病之一。主要癥狀包括痛經(jīng)、慢性盆腔痛和不孕等。近年來(lái)發(fā)病率日益上升，其高復(fù)發(fā)率始終困擾著婦產(chǎn)科醫(yī)生和廣大患者。Ems的發(fā)病機(jī)制尚不明確。STAT3是STAT家族的重要成員，STAT3的組成性激活普遍存在于人類(lèi)腫瘤中，并廣泛參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生、凋亡抵抗和免疫逃避等過(guò)程。而凋亡、血管發(fā)生、黏附侵襲和免疫正是當(dāng)前Ems發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)，被證實(shí)與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Ems類(lèi)似惡性腫瘤的生物學(xué)行為可能正是通過(guò)STAT3通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)P-STAT3(STAT3的活化形式)在子宮內(nèi)膜異位組織和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，探討PSTAT3在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用，以期為子宮內(nèi)膜異位癥的早期診斷和治療開(kāi)拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 研究組:選取秦皇島市第一醫(yī)院婦科2008年1月至2011年1月經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)的Ems患者40例的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織標(biāo)本(增殖期23例，分泌期17例)，患者年齡23～46歲，平均年齡(38±5)歲;平均體重指數(shù)(23.2±2.4)kg/m2。對(duì)照組:正常子宮內(nèi)膜組織40例(增殖期25例，分泌期15例)，年齡27～49歲，平均年齡(38±5)歲;平均體重指數(shù)(22.9±2.5)kg/m2。2組間年齡和體重指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2組患者月經(jīng)規(guī)律，除外妊娠、哺乳期女性及其他婦科合并癥，無(wú)內(nèi)外科合并癥及惡性腫瘤，術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未接受激素治療。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)試劑:一抗為兔抗人P-STAT3多克隆抗體(美國(guó)CST公司)。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑(福州邁新生物技術(shù)有限公司)。PBS緩沖液和橘櫞酸鹽緩沖液為自配。

1.2.2 檢測(cè)方法:所有標(biāo)本經(jīng)甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟、脫苯、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、抗原修復(fù)。依照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀(guān)察，并用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判斷:以子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核著色為陽(yáng)性細(xì)胞，參照Fromowitz等［1］的半定量積分法，以染色強(qiáng)度和染色范圍對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度分為:不染色計(jì)0分;弱染色(淡黃色)計(jì)1分;中等染色(黃色)計(jì)2分，強(qiáng)染色(棕黃色)計(jì)3分。染色范圍:隨機(jī)選取10個(gè)具有代表性的高倍鏡視野(×400)，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)腺上皮細(xì)胞，按照陽(yáng)性細(xì)胞百分率分為:陽(yáng)性細(xì)胞0～5%計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞6% ～25%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞26% ～50%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞51% ～75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞＞75%計(jì)3分。每張切片的兩分?jǐn)?shù)相加計(jì)算總分:0～2分為陰性(－)，3分為弱陽(yáng)性(+)，4分為陽(yáng)性(++)，5～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用非參數(shù)Wilcoxon W檢驗(yàn)、McNemar檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

P-STAT3在對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織與研究組在位和異位內(nèi)膜組織中均主要表達(dá)在腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核，間質(zhì)也有少量表達(dá)(圖1～3)。

2.1 P-STAT3在對(duì)照組子宮內(nèi)膜的表達(dá)

2.1.1 表達(dá)強(qiáng)度:P-STAT3在對(duì)照組子宮內(nèi)膜中呈弱表達(dá)，在25例增殖期中僅有1例陽(yáng)性表達(dá)，在15例分泌期中有5例陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為(－)至(+)。

2.1.2 增殖期與分泌期的表達(dá)比較l:P-STAT3在對(duì)照組子宮內(nèi)膜的表達(dá)強(qiáng)度分泌期高于增殖期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 1。

2.2 P-STAT3在研究組在位內(nèi)膜中的表達(dá)

2.2.1 組間的表達(dá)比較 P-STAT3在研究組在位內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2.2 組間增殖期的表達(dá)比較:P-STAT3在研究組在位內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 P-STAT3在對(duì)照組子宮內(nèi)膜的陽(yáng)性表達(dá)(SP×400)

圖2 P-STAT3在研究組在位內(nèi)膜的陽(yáng)性表達(dá)(SP×400)

圖3 P-STAT3在研究組異位內(nèi)膜的陽(yáng)性表達(dá)(SP×400)

2.2.3 組間分泌期的表達(dá)比較:P-STAT3在研究組在位內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.05)。見(jiàn)表1。

2.2.4 增殖期與分泌期的表達(dá)比較:P-STAT3在研究組在位內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)度增殖期與分泌期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 P-STAT3在研究組異位內(nèi)膜中的表達(dá)

2.3.1 增殖期與分泌期的表達(dá)比較:P-STAT3在研究組異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度增殖期與分泌期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.3.2 組間的表達(dá)比較:P-STAT3在研究組異位內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)度高于研究組在位內(nèi)膜和對(duì)照組子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1、2。

2.3.3 組間增殖期的表達(dá)比較:P-STAT3在研究組異位內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)度高于研究組在位內(nèi)膜和對(duì)照組子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1、3。

2.3.4 組間分泌期的表達(dá)比較:P-STAT3在研究組異位內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)度高于研究組在位內(nèi)膜和對(duì)照組子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1、4。

表1 P-STAT3在不同子宮內(nèi)膜中的表達(dá) 例

表2 P-STAT3在研究組異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的表達(dá) n=40，例

表3 P-STAT3在增殖期病例組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜中的表達(dá) n=23，例

表4 P-STAT3在分泌期研究組異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的表達(dá) n=17，例

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜基質(zhì)或上皮細(xì)胞在子宮體以外部位附著生長(zhǎng)。近年來(lái)發(fā)病率逐步上升，國(guó)外在育齡婦女的婦科腹腔鏡術(shù)中研究發(fā)現(xiàn)，EMs病變已達(dá)45%［1］。EMs具有組織侵襲、局部播散、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等類(lèi)似惡性腫瘤的生物學(xué)行為，臨床采用手術(shù)、藥物等多種治療方法，但效果并不滿(mǎn)意，復(fù)發(fā)率高。子宮內(nèi)膜異位癥的病因及發(fā)病機(jī)制至今不明，主要有子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)、誘導(dǎo)學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)等。但均未能對(duì)Ems的發(fā)病機(jī)制做出完滿(mǎn)解釋。

子宮內(nèi)膜異位癥表現(xiàn)類(lèi)似惡性腫瘤的生物學(xué)行為，及其與卵巢癌的關(guān)聯(lián)［2］，提示EMs與腫瘤間存在潛在聯(lián)系。STAT3廣泛存在人體多個(gè)組織，是JAK、EGFR、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通路的匯集點(diǎn)，在多種類(lèi)腫瘤細(xì)胞中存在STAT3過(guò)度激活，與腫瘤的異常增生、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡抵抗、血管發(fā)生和免疫抑制等密切相關(guān)。

STAT3通路是多種凋亡調(diào)節(jié)基因的上游基因，可能通過(guò)調(diào)節(jié)Ems的凋亡參與EMs的發(fā)病。對(duì)腫瘤的研究證實(shí)，伴隨STAT3的激活發(fā)生系列凋亡相關(guān)基因的改變及調(diào)亡的抑制［3］。而抗凋亡因子 Bcl-2、Survivin和促凋亡因子 Bax、Fas，C-myc、P53等通過(guò)改變Ems患者的異位內(nèi)膜、腹腔環(huán)境等的凋亡而參與EMs的發(fā)生發(fā)展。EMs類(lèi)似惡性腫瘤的凋亡抵抗、血管形成、侵襲種植等生物學(xué)行為及相對(duì)較高的惡變率可能都與凋亡異常有關(guān)。巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)異位至腹腔的內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的能力下降和異位細(xì)胞抗凋亡能力上升是Ems的發(fā)病基礎(chǔ)［4］。本次研究提示EMs異位內(nèi)膜組織中存在P-STAT3的高表達(dá)及周期性變化喪失，這與Harada等［5］的研究中發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜的調(diào)亡敏感性下降及失去周期性變化的結(jié)果相呼。

通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子調(diào)控血管生成，可能是STAT3促進(jìn)Ems發(fā)病的機(jī)制之一。子宮內(nèi)膜異位病灶在腹腔種植后需要新生血管提供營(yíng)養(yǎng)支持，所以血管生成對(duì)Ems的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。Nap等［6］發(fā)現(xiàn)血管生成抑制劑能夠顯著減少裸鼠的微血管密度和異位病灶數(shù)量，證明抑制血管發(fā)生可妨礙子宮內(nèi)膜異位病灶的維持和發(fā)展。STAT3作為重要的多功能誘導(dǎo)因子，于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)血管發(fā)生的各個(gè)方面。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是最重要的促血管生成因子。STAT3能夠直接誘導(dǎo)激活VEGF基因，還能夠誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)性因子1α(HIF-1α)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等促血管生成因子的表達(dá)。

調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性而參與EMs的侵襲，是STAT3引發(fā)Ems的又一可能機(jī)制。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類(lèi)。Osteen等［7］提出，MMPs調(diào)節(jié)系統(tǒng)的改變促進(jìn)Ems的子宮內(nèi)膜脫落，對(duì)異位內(nèi)膜細(xì)胞在腹腔的生長(zhǎng)和侵襲發(fā)揮關(guān)鍵作用。Laudanski等［8］發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)環(huán)境中MMPs表達(dá)異常導(dǎo)致蛋白溶解能力紊亂，這也與Ems發(fā)病有關(guān)。而STAT3通路正是通過(guò)調(diào)控MMPs的活性促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞黏附，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

STAT3作為免疫逃避調(diào)節(jié)的關(guān)鍵點(diǎn)，可能促成內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。內(nèi)異癥與免疫因素的關(guān)系極為密切。正常情況下腹腔液中存在能夠維持腹腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的腹膜清除系統(tǒng)。而STAT3能夠抑制免疫刺激因子和刺激免疫抑制因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤的免疫逃避。異位內(nèi)膜細(xì)胞中STAT3的高表達(dá)可能調(diào)節(jié)異位內(nèi)膜細(xì)胞的免疫逃避，降低腹腔內(nèi)環(huán)境對(duì)異位內(nèi)膜細(xì)胞的清除能力，從而促進(jìn)Ems的發(fā)生發(fā)展。

STAT3通過(guò)酪氨酸殘基或絲氨酸殘基的磷酸化而被激活。本次實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢驗(yàn)激活狀態(tài)的STAT3(PSTAT3)在EMs患者的異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，PSTAT3在Ems異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常子宮內(nèi)膜。而且，在月經(jīng)周期的不同時(shí)相中，P-STAT3在Ems異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度均高于同期正常子宮內(nèi)膜。Ems的異位內(nèi)膜組織中存在P-STAT3的異常表達(dá)，這可能正是子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病原因。

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