吳川 王秀麗 王倩 劉彥濤 董蕊 劉朋

糖尿病神經(jīng)病理性痛(diabetic neuropathic pain，DNP)發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與高血糖引起的神經(jīng)營養(yǎng)與代謝障礙有關(guān)［1］，而細(xì)胞凋亡參與了糖尿病神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展［2］，但DNP大鼠脊髓背角神經(jīng)元凋亡機(jī)制目前仍不十分清楚。本試驗(yàn)利用DNP大鼠模型，對(duì)脊髓背角的凋亡細(xì)胞及與之相聯(lián)系的凋亡蛋白酶caspase-3進(jìn)行了觀察，以探討在DNP的發(fā)展過程中，脊髓背角凋亡細(xì)胞及凋亡蛋白caspase-3的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，4周齡，體重150～170 g，室溫20～25℃，晝夜交替，自由進(jìn)食水，適應(yīng)環(huán)境5 d進(jìn)行試驗(yàn)。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)和DNP組(D組)，每組30只。

1.2 DNP模型的制備 參考文獻(xiàn)［3］介紹的方法，禁食12 h后腹腔注射鏈脲霉素(STZ，批號(hào):S0130，Sigma公司，美國)50 mg/kg，C組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。分別給予注射STZ 或0.9%氯化鈉溶液后1、2、3 周采集尾靜脈血樣0.5 ml，采用酶學(xué)方法測(cè)定空腹血糖濃度，ACCU-CHEK血糖分析儀由德國Roche公司提供，D組空腹血糖濃度＞16.7 mol/L為糖尿病模型制備成功，否則剔除，予以補(bǔ)充。采集血樣后待大鼠安靜后用Von Frey針測(cè)定機(jī)械縮足閾值;當(dāng)縮足閾值低于4 g時(shí)為糖尿病神經(jīng)痛模型成立;在腹腔注射后3、5、7周取L1～5節(jié)段脊髓組織，采用TUNNEL法和免疫組織化學(xué)法染色分別測(cè)定凋亡細(xì)胞與凋亡蛋白酶Caspase-3的表達(dá)。

1.2.1 機(jī)械縮足閾值的測(cè)定:參照文獻(xiàn)［3］介紹的方法，采用“up-and-down”方式，將大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機(jī)玻璃罩。使大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min，用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的Von Frey針(Stoelting Wood公司，美國)垂直刺激大鼠后足底，使其彎曲成S形，持續(xù)8 s，在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開Von Frey絲時(shí)發(fā)生縮足反應(yīng)，記為陽性反應(yīng)，直至出現(xiàn)第1次陽性陰性(或陰性陽性)反應(yīng)的騎跨，連續(xù)測(cè)4次。采用Dixon［4］介紹的方法計(jì)算50%縮足反應(yīng)閾值。

1.2.2 取材:分別于注射前、注射后3、5、7周每組各取10只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉下，迅速開胸，經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管，先以100 ml 0.9%氯化鈉溶液洗去血液，隨后用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH值7.4)灌注1 h，取L1～5節(jié)段脊髓組織。常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，切片(片厚5 μm)。分別行原位末端標(biāo)記法(TUNEL)和caspase-3免疫組化染色。

1.2.3 TUNEL法染色:TUNEL法檢測(cè)步驟按試劑盒(購自德國Roche公司)說明書進(jìn)行。過氧化物酶二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，陽性細(xì)胞為細(xì)胞核中有棕黃色顆粒。陰性對(duì)照:未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT酶)用含有核苷酸混合液的反應(yīng)液替代，其余步驟均相同。Olympus光學(xué)顯微鏡×400倍下觀察并計(jì)數(shù)大鼠脊髓背角TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)。根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)、大小、分布區(qū)域等，確認(rèn)脊髓背角TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 caspase-3免疫組織化學(xué)法染色:采用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行抗caspase-3染色，操作步驟按試劑說明書進(jìn)行。兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體(美國Santa Cruz公司，1∶200)，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(1∶100)均購自美國 Zymed公司。陰性對(duì)照用0.01 mol/L PBS代替caspase-3抗血清，其余步驟均相同。在Olympus光學(xué)顯微鏡×400倍下觀察并計(jì)數(shù)整個(gè)脊髓背角內(nèi)caspase-3免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)。采用Motic Digital Image病理圖像采集軟件(Olympus公司，日本)與 Quantity One軟件(Bid-Rad公司，美國)進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)本取4張切片，每張切片在脊髓背角選取大致相同部位的視野，光鏡(200倍)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取4張切片的平均值反映TUNEL染色和caspase-3陽性細(xì)胞的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組空腹血糖和機(jī)械縮足閾值比較 給予STZ后不同時(shí)點(diǎn)機(jī)械縮足閾值＜4 g;與C組比較，D組空腹血糖升高，機(jī)械縮足閾值降低 (P＜0.05)。見表1。

2.2 2組脊髓脊角凋亡細(xì)胞及Caspace-3表達(dá)比較 注射3周后與C組比較，D組各時(shí)點(diǎn)凋亡細(xì)胞及caspase-3表達(dá)均顯著增加(P＜0.05)，D組各時(shí)間點(diǎn)之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表1 2組大鼠給予STZ后不同時(shí)點(diǎn)空腹血糖及機(jī)械縮足閾值的比較n=10，

表1 2組大鼠給予STZ后不同時(shí)點(diǎn)空腹血糖及機(jī)械縮足閾值的比較n=10，

注:與C組比較，*P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)機(jī)械縮足閾值(g)3周 5周 7周3周 5周 7周.2±2.8 D 組 24.4±3.6* 27.3±3.1* 26.7±3.4* 2.9±0.4* 3.1±0.4* 3.2±0.5 C 組 5.4±0.6 5.0±0.8 4.9±0.8 12.9±2.1 13.8±2.8 11*

表2 2組大鼠給予STZ后不同時(shí)點(diǎn)脊髓背角凋亡細(xì)胞及Caspase-3表達(dá)的比較n=5，

表2 2組大鼠給予STZ后不同時(shí)點(diǎn)脊髓背角凋亡細(xì)胞及Caspase-3表達(dá)的比較n=5，

注:與 C 組比較，*P＜0.05;與3周比較，#P＜0.05;與5周比較，△P＜0.05

方法C組D 組3周 5周 7周3周 5周 7周TUNEL法 77±11 81±11 80±14 138±15* 217±14*# 322±13＊△Caspase-3染色 99±20 95±21 99±20 168±16* 230±20*# 336±20＊△

2.3 染色觀察 于脊髓背角可以觀察到TUNEL染色陽性的細(xì)胞核，呈棕黃色或黃色，對(duì)照組偶可見TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)。表達(dá)caspase-3陽性的細(xì)胞呈棕黃色，免疫陽性反應(yīng)物多定位于神經(jīng)元胞漿與突起的根部，胞核有時(shí)也有表達(dá)，在對(duì)照組可見少量表達(dá)。見圖1、2。

3 討論

糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與代謝、血管病變等因素有關(guān)［5］，糖尿病所致高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂、神經(jīng)內(nèi)膜缺血可導(dǎo)致機(jī)體過度氧化應(yīng)激。而氧化應(yīng)激是糖尿病周圍神經(jīng)病變的基礎(chǔ)［6］。高血糖可引起內(nèi)皮細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的激活，導(dǎo)致活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)生成增多，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生退行形變［7］，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡壞死、結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變。而隨著糖尿病周圍神經(jīng)病變病程的進(jìn)展，脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化的規(guī)律，未見明確報(bào)道。我們通過腹腔注射STZ，并于注射后1周開始抽取大鼠尾靜脈血檢測(cè)血糖，確保制造成功的糖尿病大鼠模型，應(yīng)用up-and-down法確保DNP大鼠造模成功。通過對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變進(jìn)程不同時(shí)點(diǎn)大鼠模型脊髓背角凋亡細(xì)胞及與之相關(guān)聯(lián)的凋亡蛋白caspase-3進(jìn)行研究，以探討隨著糖尿病周圍神經(jīng)病變的進(jìn)展，脊髓背角神經(jīng)元凋亡細(xì)胞與凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)變化。

圖1 2組大鼠脊髓背角凋亡細(xì)胞(TUNNEL×400)

圖2 2組大鼠脊髓背角凋亡蛋白Caspase-3(免疫組化×400)

研究認(rèn)為:神經(jīng)元暴露在高糖狀態(tài)下2 h即可產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并啟動(dòng)細(xì)胞的程序化死亡即細(xì)胞凋亡［8］。在糖尿病的動(dòng)物中，過氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷造成DPN中的脫髓鞘病變，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢及痛覺的出現(xiàn)。氧化應(yīng)激反應(yīng)還可通過細(xì)胞內(nèi)的各種調(diào)節(jié)通路激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如NF-κB、MAPKs等，最終改變細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)、蛋白功能，使內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元功能失調(diào)、細(xì)胞凋亡［9，10］。另外，高血糖本身還可通過產(chǎn)生advanced glycation end products(AGE)而破壞血管內(nèi)皮功能，AGE與其受體結(jié)合，激活NF-κB，引起血管炎癥，形成糖尿病神經(jīng)血管病變，最終導(dǎo)致血管神經(jīng)細(xì)胞生成減少，凋亡增加［11］，這是目前認(rèn)為引起DNP的病理學(xué)基礎(chǔ)。

神經(jīng)元氧化應(yīng)激發(fā)生后，神經(jīng)元異常放電頻率增加，表現(xiàn)為神經(jīng)元興奮性增高［12，13］，在這一系列的反應(yīng)中，ATP信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞的活化、電壓門控的離子通道(K+、Ca2+)、PKC/PLC活性均發(fā)揮重要作用，同時(shí)也與P38和JNK信號(hào)通路的活化狀態(tài)密切相關(guān)［6］。而糖尿病的糖代謝異常，直接影響了細(xì)胞外的三磷酸腺苷(extracellular adenosine triphosphate，excATP)的生理作用，使excATP生成發(fā)生變化［14］。excATP是各種病理生理?xiàng)l件下釋放到細(xì)胞外并進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)的ATP，它并不能直接向細(xì)胞提供能量，但可以在細(xì)胞間充當(dāng)信使，傳遞神經(jīng)遞質(zhì)和炎性介質(zhì)，是神經(jīng)病理性疼痛進(jìn)程中一種重要的膠質(zhì)細(xì)胞活化始動(dòng)因子。研究證實(shí):在高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)第二信使二酰甘油合成增加，并與PKC亞型調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，從而激活PKC，PKC通路的激活導(dǎo)致下游基因表達(dá)變化，如激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，使轉(zhuǎn)錄因子氧化磷酸化，改變基因表達(dá)，進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平［15，16］。在上述一系列變化中，Ca2+的參與必不可少［16］，該通路也是目前治療DNP的一個(gè)新靶點(diǎn)。

Caspases即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，Caspases的超表達(dá)和激活可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此Caspases又被稱為死亡蛋白酶，其中Caspases-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白［17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):注射STZ 3周后，脊髓背角凋亡細(xì)胞及其與之相聯(lián)系的Caspases-3蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，表明糖尿病大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)啟動(dòng) MAPK通路和Caspase通路，Caspase可激活MAPKs通路中的上游蛋白激酶，誘導(dǎo)JNK和(或)p38磷酸化，表達(dá)P53和fas配體，及核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了隨著糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)展，脊髓背角神經(jīng)元的凋亡表達(dá)呈遞增趨勢(shì)。明確了糖尿病周圍神經(jīng)病變與脊髓背角神經(jīng)元凋亡的關(guān)系，將為理解及治療糖尿病周圍神經(jīng)病變提供新的思路與方法。

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