謝明仁，鄭高鍵，高國富，張 璐，連秀珍，張 琛

(甘肅政法學(xué)院公安分院，甘肅蘭州 730070)

隨著化學(xué)用品、化學(xué)藥物在人類生活中的廣泛應(yīng)用，其安全問題已經(jīng)引起世界各國的高度重視。據(jù)文獻［1］報道，幾乎所有的化學(xué)藥物在對母體產(chǎn)生毒性的同時就引起胎兒發(fā)育減慢、畸形(四肢缺損、中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺損、無腎等)、甚至死亡。據(jù)不完全統(tǒng)計，因化學(xué)藥物導(dǎo)致胎兒畸形發(fā)生率在國外占20% ～30%，國內(nèi)占14.8%［2］。本文以 Wistar孕鼠為對象，就環(huán)磷酰胺對胎鼠腦發(fā)育的影響進行了實驗研究，以期為環(huán)磷酰胺的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗藥品、試劑環(huán)磷酰胺(cyclophosphmide，CP):由山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:20090103。兔抗Bax、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、SP卵白素試劑盒、EDTA液(北京中杉生物工程有限公司)。YA-G5000系列醫(yī)學(xué)細胞影像分析軟件(徐州永安科技發(fā)展有限公司)。

1.2實驗動物和給藥方法實驗動物:健康性成熟未育Wistar大鼠90只(♀60只，♂30只)，體質(zhì)量220～230 g，購于甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號:醫(yī)動字14-008。

全部動物在SPF級實驗室飼養(yǎng)適應(yīng)7 d，按♀ ∶♂=2∶1合籠飼養(yǎng)，室溫18～23℃。合籠后次日早晨作陰道精子涂片檢查，有精子者為已交配，當日作為“受孕”0 d。將查出的孕鼠按照妊娠時間隨機分為4組，每組15只。A組:妊娠d 7-9，腹腔注射CP;B組:妊娠d 10-12腹腔注射CP;C組:妊娠d 13-15腹腔注射CP;D組:妊娠d 7-15腹腔注射等量的生理鹽水。給藥組又分為5、8、16 mg·kg－1體重3個劑量組。各組每天給藥1次。妊娠d 20，手術(shù)解剖出胎鼠，用4%的多聚甲醛－1.25%戊二醛固定，備用。全部實驗均在甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點實驗室(甘肅政法學(xué)院)培育基地完成。

1.3Bax的免疫組織檢測取固定后的胎鼠大、小腦組織，常規(guī)脫水、包埋、切片。Bax的免疫組織檢測按SABC免疫組化試劑盒說明書操作。光鏡觀察，顯微拍照并進行圖像分析。

1.4圖像分析用YA-G5000系列醫(yī)學(xué)細胞影像分析軟件進行圖像拍照及其分析。從每組免疫組織化學(xué)切片中各選5張形態(tài)典型對應(yīng)切面，測量積分吸光度(IOD，指所測結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)各像素光密度值之和，可反映所測結(jié)構(gòu)的光密度與面積的綜合變化)、平均吸光度(MA，指被測個體的截面內(nèi)各像素的光密度值的算術(shù)平均，即為整個視野中每一點的光密度的疊加除以點數(shù)的總和，可反映組織細胞被染色的深淺)。Bax染色陽性物質(zhì)呈深淺不一的棕黃色顆粒，主要定位于細胞膜、細胞質(zhì)及核膜中。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件完成統(tǒng)計處理。組間差異比較采用t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1環(huán)磷酰胺對胎鼠大腦皮層中Bax表達的影響光鏡發(fā)現(xiàn):與對照組比，給藥組胎鼠大腦皮層細胞胞體體積減小，呈圓球形，細胞之間的突觸聯(lián)系減少，免疫陽性細胞呈彌漫或顆粒狀，胞核濃縮或碎解成小塊。其中A2組較其他各組明顯，呈強陽性反應(yīng)。細胞影像分析發(fā)現(xiàn):給環(huán)磷酰胺8 mg·kg－1體重 (A2、B2、C2 組)孕鼠組:隨給藥時間的提前，胎鼠大腦皮層中Bax的陽性表達增強，表現(xiàn)為:A2＞B2＞C2組，與對照組比差異有顯著性(P＜0.01);5 mg·kg－1體重(A1、B1、C1組)孕鼠組，隨給藥時間的提前，胎鼠大腦皮層中Bax的陽性表達雖有增強趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);16 mg·kg－1體重孕鼠組，未見成形胚胎。見Tab 1。

2.2環(huán)磷酰胺對胎鼠小腦皮層中Bax表達的影響光鏡發(fā)現(xiàn):A2組胎鼠小腦皮層中Bax表達強于其它各組，陽性細胞分布密集，胞體著色深，胞質(zhì)和胞核均有表達。細胞影像分析發(fā)現(xiàn):給環(huán)磷酰胺5、8 mg·kg－1體重孕鼠組:胎鼠小腦皮層中Bax表達隨給藥時間的提前而增強，與對照組比差異有顯著性(P＜0.05～0.01);16 mg·kg－1體重孕鼠組，未見成形胚胎。見Tab 2。

Tab 1 Effect of cyclophosphamide on the expression of Bax in the cerebral cortex of fetal rats(±s，n=5)

Tab 1 Effect of cyclophosphamide on the expression of Bax in the cerebral cortex of fetal rats(±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs D group

Index A1 A2 B1 B2 C1 C2 C3 D IOD 9.0 ±0.1* 12.8 ±0.4＊＊ 7.3 ±0.7 10.6 ±0.9* 6.7 ±0.9 6.9 ±0.8 9.4 ±0.2*5.1 ±0.7 MA 0.218 0.310 0.176 0.256 0.163 0.169 0.227 0.140±0.007* ±0.002＊＊ ±0.008 ±0.006* ±0.002 ±0.004 ±0.006*±0.006

Tab 2 Effect of cyclophosphamide on the expression of Bax in the cerebellum cortex of fetal rats(±s，n=5)

Tab 2 Effect of cyclophosphamide on the expression of Bax in the cerebellum cortex of fetal rats(±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs D group

Index A1 A2 B1 B2 C1 C2 C3 D IOD 7.2 ±0.2* 10.5 ±0.1＊＊ 7.2 ±0.7* 5.5 ±0.3* 4.9 ±0.7 4.9 ±10.3 9.7 ±0.7*4.2 ±0.9 MA 0.174 0.263 0.206 0.133 0.119 0.119 0.234 0.109±0.003* ±0.004＊＊ ±0.003* ±0.005* ±0.001 ±0.007 ±0.005*±0.003

3 討論

目前，臨床應(yīng)用的抗腫瘤藥物種類繁多［3］，它們在抑制腫瘤生長的同時也嚴重影響患者的健康，還嚴重影響胚胎發(fā)育程序［4］，影響胚胎出生后幼仔的遠期損傷。環(huán)磷酰胺是一種臨床上常用的抗癌藥，是細胞周期非特異性的廣譜抗腫瘤藥［5］，它進入腫瘤細胞后能分解出磷酰胺氮芥，與DNA發(fā)生烷化，形成交叉聯(lián)結(jié)，干擾DNA及RNA功能，抑制腫瘤細胞的生長繁殖。環(huán)磷酰胺同時又是一種公認的誘變劑，能致正常細胞突變，對造血系統(tǒng)和免疫功能［6］具有明顯的抑制作用，使外周血白細胞和骨髓有核細胞明顯減少，CD4/CD8 T淋巴細胞亞群比值降低。生殖系統(tǒng)對化學(xué)毒物的作用十分敏感，在其他系統(tǒng)還未出現(xiàn)毒性反應(yīng)之前，生殖系統(tǒng)可能已受損害。據(jù)統(tǒng)計，環(huán)磷酰胺對中青年性腺抑制發(fā)生率達12%～83%，在女性，主要是低雌激素血癥引起的更年期癥狀，表現(xiàn)為潮熱、陰道干燥、性欲下降、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、卵巢功能早衰(40歲前絕經(jīng))、不育、失眠及抑郁等;在男性，引起精子缺乏，降低睪丸間質(zhì)細胞功能，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。實驗結(jié)果證明，環(huán)磷酰胺明顯抑制胎鼠骨骼發(fā)育和腦的形成，導(dǎo)致腦畸形發(fā)育［7］。本文在大鼠胚胎發(fā)育的不同時間給予不同劑量的環(huán)磷酰胺，胚胎發(fā)育d 20解剖出胎鼠，發(fā)現(xiàn)，給予孕鼠16 mg·kg－1體重環(huán)磷酰胺后，未見成形胚胎。在受孕d 7-9，分別給予5、8 mg·kg－1體重環(huán)磷酰胺，胎鼠大、小腦皮層中Bax表達比d 13-15給藥明顯增強(P＜0.01)。結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺對胚胎發(fā)育有明顯的毒性作用，其毒性隨給藥濃度增大和給藥時間的提前而增強。本實驗結(jié)果為環(huán)磷酰胺的臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

［1］Janine E，Polifka J M.Friedman.Medical genetics:1.Clinical teratology in the age of genomics［J］.Canadian Med Associat Its Licensors，2002，167(3):265 －73.

［2］楊照彥，劉方安.化學(xué)藥品對人類胚胎的毒性影響［J］.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1994，17(1):13 －7.

［2］Yang Z Y，Liu F A.Toxicological effects of chemicals on human embryonic［J］.J Binzhou Med Univ，1994，17(1):13 － 7.

［3］沈 杰，張冬梅，徐力致，等.一種新型低毒的有機銅化合物的合成、鑒定及抗腫瘤活性研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(1):137－9.

［3］Shen J，Zhang D M，Xu L Z，et al.A study on the synthesis，identification and antitumor properties of a novel low toxic organic copper complex［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):137 －9.

［4］Rutledge J C.Developmental toxicity induced during early stages of mammalian embryogenesis［J］.Mutat Res，1997，396:113.

［5］Lear L，Nation R L，Stupans I.Effects of CP and adriamycin on rat hepatic microsomal glucuronidation andlipid peroxidation［J］.Biochem Pharmacol，1992，44:747 －53.

［6］包晶晶，林海霞，馬 璟.CFSE示蹤與流式細胞儀檢測法研究環(huán)磷酰胺對T淋巴細胞增殖的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(6):828 －31.

［6］Bao J J，Ling H X，Ma J.The research of lymphocyte proliferation using CFSE and FCM［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):828－31.

［7］謝明仁，俞詩源，張 璟，等.環(huán)磷酰胺對大鼠胚胎腦及骨骼發(fā)育的毒性作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(2):187 －90.

［7］Xie M R，Yu S Y，Zhang J，et al.Toxic effect of cyclophosphamide on the embryonic cerebral and skeleton development of rat［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(2):187 －90.