李明軒 耿春銀 張 敏

農(nóng)作物秸稈是最豐富的木質(zhì)纖維素資源[1]，稻草作為我國產(chǎn)量最多的秸稈飼料，消化蛋白質(zhì)含量低，粗纖維含量較高，很大一部分的纖維素不能被畜禽類胃腸道消化分解，要靠體外的強酸、強堿以及特定的微生物來分解，以至于營養(yǎng)價值很低[2]。稻草資源在我國具有分布廣，產(chǎn)量大，價格低廉的特點，但是利用率很低。這是因為稻草主要由纖維素、半纖維和木質(zhì)素組成，其木質(zhì)素含量很低，但它緊緊的包裹在纖維素的表面，并且與纖維素、半纖維素有著較牢固的化學(xué)連接,這樣就使秸稈的利用率大大降低[3]。本試驗就是利用白腐菌先降解纖維素外圍的木質(zhì)素，更有利于康氏木霉對纖維素的降解，試驗采用康氏木霉、白腐菌、酵母菌混合培養(yǎng)發(fā)酵稻草，提高了稻草利用率及其營養(yǎng)價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

康氏木霉(Trichodrma pseudokoning)由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物營養(yǎng)實驗室提供；

白腐菌 5.132（Fomes lignosus）購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心；

酵母菌（Yeast Bacteria）由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物營養(yǎng)實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

CPDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸提液1 ml；葡萄糖20 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、維生素 B1微量、瓊脂15 g，pH 值 6.0；

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g，水 1000 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌 30 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草6 g、麩皮4 g，自然pH值，營養(yǎng)液6 ml；營養(yǎng)液構(gòu)成：蔗糖22.8 g、(NH4)2SO410 g、K2HPO45 g、MgSO42.5 g、水 1000 ml。

1.1.3 主要試劑

①DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸顯色液）；②1%乙酸－乙酸鈉緩沖溶液（pH值為4.8）；

③1%CMC溶液：羧甲基纖維素鈉（CMC）1 g以pH值4.8醋酸緩沖液定容至100 ml。

1.2 方法

1.2.1 菌種間相容性試驗[4]

1.2.1.1 康氏木霉和酵母菌

酵母菌接種PDA培養(yǎng)基平板，再接種康氏木霉菌種于其上，另一PDA培養(yǎng)基平板上接康氏木霉菌種，作為對照。培養(yǎng)條件：28℃靜置培養(yǎng)5 d。

1.2.1.2 白腐菌與酵母菌

酵母菌接種CPDA培養(yǎng)基平板，再接種白腐菌種于其上，另一CPDA培養(yǎng)基平板上接白腐菌菌種，作為對照。培養(yǎng)條件：室溫下培養(yǎng)。

1.2.1.3 康氏木霉與白腐菌

將康氏木霉與白腐菌接入到同一PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)5 d，觀察其生長情況，比較同一平板上兩種菌種的生長情況，為下一步混合發(fā)酵做參考。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗

采用正交試驗來確定康氏木霉、白腐菌與酵母菌混合發(fā)酵稻草秸稈飼料的最佳培養(yǎng)基。采用三因素三水平正交試驗方法，三水平為稻草：麩皮(A)、尿素(B，氮源%)、營養(yǎng)液(C,%)，正交試驗因素水平見表1。發(fā)酵前后測定原料中的羥甲基纖維素酶活性、粗纖維和粗蛋白含量。

表1 L9(33)正交試驗因素水平

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素篩選試驗

1.2.3.1 發(fā)酵時間

按1 ml接種量（康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：1：1）接種于上述優(yōu)化培養(yǎng)基中，在室溫的條件下分別培養(yǎng) 5、6、7、8、9、10 d 發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的羧甲基纖維素酶活性、粗纖維和粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.3.2 接種量

分別按1、1.5、2、2.5和3 ml接種量（康氏木霉： 白腐菌：酵母菌=1：1：1）接種于上述優(yōu)化培養(yǎng)基中，在室溫的條件下分別培養(yǎng)6 d，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的羧甲基纖維素酶活性、粗纖維和粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.3.3 接種比例

按1 ml接種量（康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：1： 1，1： 2： 2，1： 3： 3，1： 2： 1，2： 1： 2，3： 1： 3）接種于上述優(yōu)化培養(yǎng)基中，在室溫的條件下分別培養(yǎng)6 d，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的羧甲基纖維素酶活性、粗纖維和粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 最佳條件下的發(fā)酵試驗

在上述正交試驗和單因素篩選出的最佳條件下進(jìn)行混合菌種發(fā)酵稻草的試驗。

1.2.5 測定指標(biāo)

羧甲基纖維素酶（CMC）測定采用DNS還原糖測定法；粗纖維含量測定：采用酸-堿洗滌法(張麗英，2007)[5]；粗蛋白質(zhì)含量測定：采用凱氏定氮法(張麗英，2007)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種兼容性試驗

2.1.1 康氏木霉與酵母菌

與對照組相比，康氏木霉在酵母菌做成的平板長得好，比較旺盛，但是生長蔓延得速度較慢，充分說明了酵母菌與康氏木霉之間不存在抑制作用，與史國翠(2011)[7]報道的一致，酵母菌利用分解培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)，分解產(chǎn)物促進(jìn)康氏木霉的生長。

2.1.2 白腐菌與酵母菌

白腐菌在有酵母菌的平板中比對照組的菌絲更濃密，更粗更壯，但蔓延的速度相對較慢，試驗表明酵母菌與白腐菌之間沒有拮抗作用并且互利共生，因為酵母菌能分解利用培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)，降解的糖和其它的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)白腐菌的生長，即使白腐菌生長得很好，菌絲潔白，粗壯，但白腐菌的生長仍然受到限制，菌絲在平板中蔓延的很慢，可能是因為酵母菌鋪滿整個平板，白腐菌沒有生長的空間。

2.1.3 康氏木霉與白腐菌

白腐菌的生長與康氏木霉比較相對較慢，康氏木霉先長滿整個平板，說明兩者之間可以兼容共生，但白腐菌絲生長多少受到一些抑制，也許因為康氏木霉生長的更快，爭奪了白腐菌絲的生長空間，使它無法生長，長滿整個平板需要較長的時間。

2.2 最優(yōu)培養(yǎng)基的確定

通過三因素三水平的正交試驗確定了多菌種混合發(fā)酵稻草的最優(yōu)培養(yǎng)基，結(jié)果見表2。

三因素三水平正交試驗結(jié)果極差（R）分析可以看出纖維素酶活性、粗蛋白和粗纖維優(yōu)化條件一致，影響因素次序為：A>B>C，影響最大的是稻草與麩皮的比，其次是尿素的添加量，最后是營養(yǎng)液的添加量，從極差表中的數(shù)據(jù)綜合分析可以得出，混合菌種發(fā)酵稻草的最優(yōu)培養(yǎng)基為A2B2C2，即稻草：麩皮=6：4,尿素添加量2%，營養(yǎng)液添加量60%。此時，發(fā)酵獲得纖維素酶活性、蛋白質(zhì)都較高，粗纖維的含量最低。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化單因素篩選

2.3.1 混發(fā)酵時間的確定

多菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶和蛋白質(zhì)合成都是隨著發(fā)酵時間變化呈現(xiàn)不同的變化趨勢，從圖1、圖2可以看出，酶活性和粗蛋白在發(fā)酵的第6 d均最高，粗纖維含量最低，此后繼續(xù)發(fā)酵結(jié)果則相反。因為菌體生長階段隨著時間的不同出現(xiàn)穩(wěn)定期和最高生長期，菌種數(shù)量越多，產(chǎn)酶量就越大，蛋白含量越高，纖維素酶把纖維素降解之后的二糖或單糖，被酵母菌利用吸收轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，來降低粗纖維的含量，發(fā)酵時間越長，菌種過了最高生長期，菌絲數(shù)量減少，從而使纖維素酶活力和粗蛋白含量降低，導(dǎo)致粗纖維含量增加。

2.3.2 混菌發(fā)酵接種量的確定

接種量對試驗的結(jié)果有一定的影響，從圖3、圖4可以看出，多菌接種量為2 ml時，纖維素酶活性和粗蛋白含量最高，粗纖維含量最低，這是因為接種量過少產(chǎn)酶量也減少，降解纖維素的能力就隨之下降，轉(zhuǎn)化的粗蛋白的含量也減少；當(dāng)菌種過量，互相又競爭生長空間和養(yǎng)分，進(jìn)而導(dǎo)致微生物菌群生長不好，也符合上述菌種兼容試驗的結(jié)果，故最適宜的接種量為2 ml。

表2 正交試驗結(jié)果極差分析

圖1 發(fā)酵時間對纖維素酶活性的影響

圖2 發(fā)酵時間對粗蛋白和粗纖維含量的影響

圖3 接種量對纖維素酶活性的影響

圖4 接種量對粗蛋白和粗纖維含量的影響

2.3.3 混菌發(fā)酵接種比例的確定

纖維素酶在水解纖維素產(chǎn)葡萄糖過程中，葡萄糖和纖維素二糖對纖維素酶有很強烈的反饋抑制作用，這就影響了纖維素的水解速度和程度[8]，若能將利用纖維素水解產(chǎn)物的菌種和分解纖維素酶的菌種混合發(fā)酵，就能更徹底，更快的分解纖維素。本試驗采用了康氏木酶、白腐菌和酵母菌的混合發(fā)酵，白腐菌能分解稻草中的木質(zhì)素，為康氏木霉降解纖維素提供了便利，康氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素分解的纖維素二糖等糖類物質(zhì)，酵母菌可以利用這些單糖、雙糖物質(zhì)生長并將培養(yǎng)物中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，從而使稻草的營養(yǎng)價值提高，粗纖維降低。從圖5、圖6可以看出康氏木霉： 白腐菌：酵母菌=1：2：1時，纖維素酶活性和蛋白質(zhì)含量最大，粗纖維含量最低。

圖5 接種比例對纖維素酶活性的影響

圖6 接種比例對粗蛋白和粗纖維含量的影響

2.4 最優(yōu)化條件的發(fā)酵試驗

通過正交試驗和優(yōu)化單因素試驗，確定了康氏木霉、白腐菌、酵母菌混合發(fā)酵稻草的最佳條件為：稻草：麩皮6：4，尿素2%，營養(yǎng)液60%，自然pH值。混合菌種接種量為2 ml，接種比例（康氏木霉：白腐菌：酵母菌）1：2：1，培養(yǎng)6 d，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3 最優(yōu)條件下發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白和粗纖維含量(%)

從表3可以看出，在最優(yōu)的條件下，發(fā)酵最終產(chǎn)物中的粗蛋白含量高于以上的任何條件，為18.59%，比發(fā)酵前提高了15.1個百分點。粗纖維含量也很低，為23.17%，比發(fā)酵前降低了21.39個百分點。

3 討論

微生物處理秸稈飼料的報道日益增多，其研究越來越受到關(guān)注，很多文獻(xiàn)說明混菌發(fā)酵的效果要好于單一菌種的發(fā)酵效果，薛泉宏等[9]研究了2種曲霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的情況，結(jié)果表明2種曲霉按一定比例接種較單菌發(fā)酵產(chǎn)酶大幅度提高。主要因為混菌之間有共生和營養(yǎng)作用，能克服發(fā)酵過程中產(chǎn)生的不利影響，增加發(fā)酵的效果。微生物發(fā)酵秸稈飼料產(chǎn)纖維素酶是一種利用天然資源的有效方式，為微生物資源開發(fā)提供廣闊的前景，極大地推動我國飼料和畜牧業(yè)發(fā)展。

本試驗用多種菌種混合發(fā)酵稻草，利用木質(zhì)素將纖維素外圍包裹的木質(zhì)素降解之后，促進(jìn)了康氏木霉對纖維素的降解效果，分解之后的纖維素二糖和簡單的糖類物質(zhì)被酵母菌吸收利用合成菌體蛋白，從而達(dá)到降解粗纖維的目的，試驗在室溫的條件下進(jìn)行的，接近實際生產(chǎn)效果，但還是存在一定的差距，在今后的生產(chǎn)中要應(yīng)用各種途徑和方法探索多菌發(fā)酵之間的拮抗和共生的關(guān)系，加強微生物發(fā)酵秸稈飼料工藝的研究。

4 小結(jié)

試驗結(jié)果表明，康氏木霉與酵母菌之間無拮抗作用，酵母菌與白腐菌互生共利白腐菌與康氏木霉之間存在競爭性，但通過混合菌種優(yōu)化條件的篩選，能降低拮抗?；旌暇l(fā)酵稻草最佳培養(yǎng)基為：稻草：麩皮=6：4，2%的尿素，營養(yǎng)液60%，自然pH值。混合菌種(康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：2：1)接種量為2 ml，培養(yǎng)6 d為最佳。

[1]孫芹英，葛春梅.白腐菌混合發(fā)酵產(chǎn)酶及對秸稈木質(zhì)纖維素的降解研究[J].工業(yè)微生物,2009,10:13.

[2]廖雪義,代青,余海忠.多種混合發(fā)酵秸稈生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料的研究[J].中國飼料,2009,16:8-14.

[3]王志,陳雄,王實玉.擬康氏木霉和白腐菌混菌發(fā)酵處理稻草秸稈的研究[J].可再生資源,2009,27(4):36-38.

[4]李智明.復(fù)合菌種發(fā)酵秸稈蛋白質(zhì)飼料[M].成都理工大學(xué),2006,5:29-34.

[5]張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)(3版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007(10):52-56.

[6]張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)(3版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007(10):67-70.

[7]史國翠.康氏木霉與酵母菌混合發(fā)酵處理稻草秸稈的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(4):1421-1422.

[8]張英.微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的研究進(jìn)展[J].釀酒,2010,5:20-22.

[9]薛泉宏,司美茹,等.多元混菌發(fā)酵對纖維素酶活性的影響[J].工業(yè)微生物,2004(3):30-34.