單達(dá)聰 王四新 劉蘋(píng)蘋(píng) 季海峰 劉 輝

微生物固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝效率高、成本低、無(wú)污染，是降解大豆抗原蛋白等蛋白質(zhì)類(lèi)抗?fàn)I養(yǎng)因子與改善營(yíng)養(yǎng)效價(jià)的可行方法。發(fā)酵豆粕工藝過(guò)程的目的之一是達(dá)到較高的蛋白質(zhì)水解度（DH），以利用微生物產(chǎn)生的蛋白酶降解大豆抗原蛋白質(zhì)消除其抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)降低大豆蛋白質(zhì)的分子量利于提高利用效率和形成有益的功能小肽。微生物發(fā)酵豆粕過(guò)程產(chǎn)生很寬的酶譜，在降解蛋白質(zhì)的同時(shí)，轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶等將氨基酸分解轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生各種胺類(lèi)含氮物，出現(xiàn)揮發(fā)性鹽基總氮（TVBN）的累積，造成豆粕蛋白質(zhì)中某些重要氨基酸的損失。因此，研究固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝參數(shù)中眾多因素對(duì)蛋白質(zhì)降解過(guò)程中各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)的影響，以及它們與蛋白質(zhì)水解度的關(guān)系，對(duì)確定發(fā)酵工藝參數(shù)及其產(chǎn)品品質(zhì)的評(píng)價(jià)具有非常重要的意義，目前相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。為此采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行試驗(yàn)，研究固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝參數(shù)中，菌種組合、豆粕前處理方法、豆粕加水量等對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響，包括揮發(fā)性鹽基總氮、蛋白質(zhì)水解度、賴(lài)氨酸（Lys.）、精氨酸（Arg.）、蛋氨酸（Met.）、蛋氨酸+胱氨酸（M+C）、蘇氨酸（Thr.）等，同時(shí)分析蛋白質(zhì)水解度與各指標(biāo)的相關(guān)及回歸關(guān)系，為優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝參數(shù)組合，以及評(píng)價(jià)發(fā)酵豆粕品質(zhì)提供科學(xué)技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種和豆粕

米曲霉（Aspergillus oryzae）孢子干粉制劑，孢子含量≥5×109個(gè)/g。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）干粉制劑，活菌數(shù)≥2×1010cfu/g。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)干粉制劑，活菌數(shù)≥2×1010cfu/g。

普通豆粕，普通豆油生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的豆粕。

擠壓豆粕，增加擠壓工序生產(chǎn)的豆粕。

膨化豆粕，普通豆粕經(jīng)TSE-65雙螺桿膨化機(jī)膨化。

1.2 設(shè)施、設(shè)備與儀器

9F-320-2勁錘式粉碎機(jī)，河北省蠡縣農(nóng)機(jī)修造廠(chǎng)；TSE-65雙螺桿小型干法膨化機(jī)，北京現(xiàn)代洋工機(jī)械科技發(fā)展有限公司；發(fā)酵溫室；不銹鋼發(fā)酵曲盤(pán)、可密封塑料袋；全自動(dòng)定氮儀、高效液相色譜儀、分析天平。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)因素與水平

試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，其組合處理樣品的方法采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，設(shè)置空列和2次重復(fù)。

1.3.2 操作方法

表1 試驗(yàn)因素與水平

采用固態(tài)發(fā)酵工藝，好氧與厭氧結(jié)合連續(xù)進(jìn)行。9個(gè)處理，兩次重復(fù)共18個(gè)樣品，每樣品風(fēng)干基礎(chǔ)豆粕2000 g，接種量1%。接種、加水、混合均勻后裝入不銹鋼淺盤(pán)加透氣蓋，置于28℃溫室好氧發(fā)酵24 h；好氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)加水同時(shí)接種，混合均勻后轉(zhuǎn)入塑料袋排氣密封置于37℃溫室，厭氧發(fā)酵與酶解3周。在好氧發(fā)酵結(jié)束及厭氧發(fā)酵的第一、二、三周末分別取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

氨基酸含量(%)，采用高效液相色譜HPLC法檢測(cè)17種氨基酸含量[1]；

揮發(fā)性鹽基總氮(%)，采用半微量凱氏定氮法[2]；

氨基氮含量采用電位滴定法檢測(cè)[3]，總氮含量采用《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定GB/T 5009.5—2010》第一法中的自動(dòng)凱氏定氮儀法。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分別計(jì)算各試驗(yàn)因素水平間的指標(biāo)值極差并排序，分析試驗(yàn)因素的影響力；分別對(duì)試驗(yàn)因素內(nèi)縱向水平間的指標(biāo)值進(jìn)行方差分析比較，確定各水平之間的差異程度；分析蛋白質(zhì)水解度與各指標(biāo)間線(xiàn)性相關(guān)和回歸曲線(xiàn)估計(jì)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果指標(biāo)值以X±SD，水平間極差值以R表示，指標(biāo)間線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)以r表示，決定系數(shù)以R2表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵各階段試驗(yàn)因素與水平對(duì)揮發(fā)性鹽基總氮的影響(見(jiàn)表2)

表2 各發(fā)酵階段揮發(fā)性鹽基氮含量極差與方差分析結(jié)果(mg/100 g)

揮發(fā)性鹽基總氮含量反映發(fā)酵豆粕的氨基酸損失和腐敗程度，因此其值越低越好。表2可見(jiàn)，好氧發(fā)酵階段由極差確定的試驗(yàn)因素影響力排序?yàn)椋築＞C＞A。其中豆粕前處理因素三水平均值比較：A3＞A1＞A2，A3顯著高于A(yíng)1和A2（P＜0.05）；菌種組合因素三水平均值比較：B1＞B3＞B2，B1和B3顯著高于B2（P＜0.05）；加水量組合因素三水平比較：C3＞C2＞C1，C3顯著高于 C1（P＜0.05）。以降低發(fā)酵豆粕揮發(fā)性鹽基總氮為目標(biāo)，好氧發(fā)酵階段的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A2B2C1。

厭氧發(fā)酵階段由極差確定的試驗(yàn)因素影響力排序與好氧階段相同，即B＞C＞A。豆粕前處理三種方法均值比較：A3＞A2＞A1，A3顯著高于A(yíng)1（P＜0.05）；菌種組合因素三水平均值比較：B1＞B3＞B2，B1極顯著高于 B2（P＜0.01）；加水量組合因素三水平均值比較：C3＞C2＞C1，C3顯著高于C1（P＜0.05）。厭氧階段優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A1B2C1。

以試驗(yàn)全程而言，由極差確定的試驗(yàn)因素影響力排序與前兩個(gè)階段相同，即B＞C＞A。豆粕前處理三種方法均值比較：A3＞A2＞A1，A3顯著高于A(yíng)1（P＜0.05）；菌種組合因素三水平均值比較：B1＞B3＞B2，B1極顯著高于B2（P＜0.01）；加水量組合因素三水平均值比較：C3＞C2＞C1，C3極顯著高于C1（P＜0.01）。發(fā)酵全程優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A1B2C1。

2.2 發(fā)酵全程試驗(yàn)因素與水平對(duì)發(fā)酵豆粕主要氨基酸的影響(見(jiàn)表3)

表3 發(fā)酵全程主要氨基酸含量極差與方差分析結(jié)果(%)

大豆蛋白質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中的水解可直接對(duì)豆粕氨基酸營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)生影響，分析表3可見(jiàn)，發(fā)酵試驗(yàn)全程各試驗(yàn)因素與水平的影響規(guī)律。對(duì)賴(lài)氨酸而言，試驗(yàn)因素影響力排序?yàn)椋篊＞A＞B，以試驗(yàn)因素各水平均值比較：A1＞A3＞A2、B3＞B2＞B1、C1＞C2＞C3，其中 C 因素中 C1極顯著高于C3（P＜0.01）。以提高賴(lài)氨酸含量為目標(biāo)的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A1B3C1；對(duì)蛋氨酸而言，試驗(yàn)因素影響力排序?yàn)椋篊＞A＞B，以試驗(yàn)因素各水平均值比較：A3＞A1＞A2、B1＞B3＞B2、C3＞C2＞C1。其中 A 因素中 A3極顯著高于 A2（P＜0.01），B 因素中 B1顯著高于 B2（P＜0.05），C因素中C3和C2極顯著高于C1（P＜0.01）。以提高蛋氨酸含量為目標(biāo)的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A3B1C3；對(duì)精氨酸而言，試驗(yàn)因素影響力排序?yàn)椋築＞A＞C，以試驗(yàn)因素各水平均值比較：A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C2＞C1＞C3。其中A1和A2極顯著高于A(yíng)3（P＜0.01），B2和B3極顯著高于B1（P＜0.01），C因素各水平?jīng)]有顯著差異（P＞0.05）。以提高精氨酸含量為目標(biāo)的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A1B2C2；對(duì)胱氨酸和蘇氨酸而言，各因素水平間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），以提高含量為目標(biāo)的工藝優(yōu)化參數(shù)組合為A3B1C2和A3B1C3。

2.3 不同發(fā)酵階段試驗(yàn)因素與水平對(duì)發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度的影響(見(jiàn)表4)

表4 發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度極差與方差分析結(jié)果(%)

分析表4，好氧發(fā)酵階段由極差確定的試驗(yàn)因素影響力排序?yàn)椋篈＞C＞B。其中豆粕前處理因素三水平均值比較：A3＞A2＞A1，菌種組合因素三水平均值比較：B3＞B1＞B2，加水量組合因素三水平比較：C3＞C2＞C1。方差分析表明：A3顯著高于A(yíng)1和A2（P＜0.05）；C3顯著高于C1（P＜0.05）。以提高蛋白質(zhì)水解速度為目標(biāo)的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A3B3C3。

好氧24 h+厭氧1周發(fā)酵階段，由極差確定的試驗(yàn)因素影響力排序?yàn)椋築＞A＞C。其中菌種組合因素三水平均值比較：B1＞B3＞B2，加水量組合因素三水平均值比較：C3＞C2＞C1，豆粕前處理三種方法均值比較：A3＞A2＞A1。方差分析表明：B1極顯著高于 B2(P＜0.01)，B3顯著高于B2（P＜0.05）。以提高蛋白質(zhì)水解度為目標(biāo)的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A3B1C3。

以試驗(yàn)全程而言，由極差確定的試驗(yàn)因素影響力排序?yàn)椋築＞C＞A。其中菌種組合因素三水平均值比較：B1＞B3＞B2，加水量組合因素三水平均值比較：C3＞C2＞C1，豆粕前處理三種方法均值比較：A3＞A2＞A1。方差分析比較表明：A3極顯著高于 A1（P＜0.01）；B1極顯著高于B2（P＜0.01），顯著高于B3（P＜0.05）；C3極顯著高于C1（P＜0.01），顯著高于C2（P＜0.05）。試驗(yàn)全程的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A3B1C3。

2.4 發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度與其他指標(biāo)的線(xiàn)性相關(guān)

蛋白酶水解大豆蛋白質(zhì)切斷肽鍵使肽鏈變短，最終成為游離型單體氨基酸。而脫羧酶或轉(zhuǎn)氨酶對(duì)氨基酸的繼續(xù)分解則產(chǎn)生胺類(lèi)含氮物（以揮發(fā)性鹽基總氮表示），同時(shí)會(huì)對(duì)主要的限制性必須氨基酸含量產(chǎn)生影響而影響到發(fā)酵豆粕的品質(zhì)。為研究隨蛋白質(zhì)水解度的提高鹽基氮和氨基酸含量的變化規(guī)律，將相關(guān)系數(shù)列于表5。

表5 發(fā)酵全程蛋白質(zhì)水解度與主要氨基酸含量的相關(guān)系數(shù)（r）

分析表5蛋白質(zhì)水解度與各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)可見(jiàn)：與揮發(fā)性鹽基總氮存在高度正相關(guān)（P＜0.01），且好氧發(fā)酵階段與試驗(yàn)全程表現(xiàn)極為一致，r分別為0.958和0.972；與賴(lài)氨酸含量存在較高的負(fù)相關(guān)，r值在好氧發(fā)酵階段和試驗(yàn)全程分別為－0.495和－0.751（P＜0.01）；與精氨酸含量存在高度負(fù)相關(guān)（P＜0.01），且在好氧發(fā)酵階段和試驗(yàn)全程表現(xiàn)極為一致，r值分別為－0.945和－0.913。

蛋白質(zhì)水解度與蛋氨酸、（蛋+胱）氨酸表現(xiàn)基本一致，即好氧階段相關(guān)性很低（P＞0.05），但試驗(yàn)全程則高度正相關(guān)（r：0.988、0.926，P＜0.01）；與蘇氨酸的相關(guān)性，好氧發(fā)酵階段為負(fù)相關(guān)（r=－0.639，P＞0.05），試驗(yàn)全程為正相關(guān)（r=0.862，P＜0.01）。

可見(jiàn)，隨蛋白質(zhì)水解度提高：揮發(fā)性鹽基氮含量提高，賴(lài)氨酸和精氨酸含量下降；（蛋+胱）氨酸含量在厭氧發(fā)酵階段提高；蘇氨酸在好氧階段降低，在厭氧發(fā)酵階段提高。隨發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度提高，在不同發(fā)酵階段、不同指標(biāo)的關(guān)系存在不同，這是在確定發(fā)酵工藝時(shí)應(yīng)該特別注意的。

2.5 蛋白質(zhì)水解度與各指標(biāo)回歸關(guān)系

將蛋白質(zhì)水解度與鹽基氮、賴(lài)氨酸、精氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、蛋胱氨酸的回歸關(guān)系列于表6。曲線(xiàn)預(yù)測(cè)估計(jì)圖分別見(jiàn)圖 1、圖 2、圖 3、圖 4、圖 5、圖 6。

表6 蛋白質(zhì)水解度與各指標(biāo)回歸曲線(xiàn)估計(jì)參數(shù)

分析表6中的回歸估計(jì)參數(shù)可見(jiàn)：蛋白質(zhì)水解度與揮發(fā)性鹽基氮、賴(lài)氨酸、精氨酸含量均呈現(xiàn)線(xiàn)性回歸關(guān)系，但斜率不同，分別為 19.07、-0.0458、-0.0489。即隨蛋白質(zhì)水解度的提高，鹽基氮上升、賴(lài)氨酸和精氨酸含量下降(見(jiàn)圖1、圖2、圖3)；蛋白質(zhì)水解度與蘇氨酸含量呈二次回歸關(guān)系，隨蛋白質(zhì)水解度的提高，蘇氨酸含量先下降而后上升，拐點(diǎn)的蛋白質(zhì)水解度為20%左右(見(jiàn)圖4)；蛋白質(zhì)水解度與蛋氨酸和（蛋+胱）氨酸均呈現(xiàn)三次回歸關(guān)系，即隨蛋白質(zhì)水解度的提高，二者先略有提高，而后平移，然后上升，第一拐點(diǎn)在20%左右，第二拐點(diǎn)在30%左右(見(jiàn)圖5和圖6)。

圖1 水解度與揮發(fā)性鹽基氮曲線(xiàn)

圖2 水解度與賴(lài)氨酸曲線(xiàn)關(guān)系

圖3 水解度與精氨酸曲線(xiàn)

圖4 水解度與蘇氨酸曲線(xiàn)

圖5 水解度與蛋氨酸曲線(xiàn)

圖6 水解度與(蛋+胱)氨酸曲線(xiàn)

3 小結(jié)與討論

固態(tài)發(fā)酵豆粕在降解蛋白質(zhì)過(guò)程中不可避免地會(huì)使得部分游離氨基酸繼續(xù)分解而產(chǎn)生胺類(lèi)含氮物，這樣即損失了可貴的氨基酸，同時(shí)積累的揮發(fā)性鹽基氮還會(huì)對(duì)仔豬營(yíng)養(yǎng)造成不利影響。因此，揮發(fā)性鹽基總氮、蛋白質(zhì)水解度、賴(lài)氨酸、精氨酸、蛋氨酸、（蛋+胱）氨酸、蘇氨酸等指標(biāo)對(duì)評(píng)價(jià)發(fā)酵豆粕品質(zhì)具有重要參考價(jià)值，并且在蛋白質(zhì)水解過(guò)程受到眾多發(fā)酵參數(shù)的作用與影響,綜合分析可見(jiàn)如下基本結(jié)論。

3.1 關(guān)于試驗(yàn)因素的影響力和工藝參數(shù)組合優(yōu)化

發(fā)酵各階段試驗(yàn)因素對(duì)揮發(fā)性鹽基總氮累積量的影響力排序相同，即菌種組合＞加水量組合＞豆粕前處理方法，以降低其含量為目標(biāo)的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A1B2C1。

試驗(yàn)因素對(duì)賴(lài)氨酸含量的影響力排序?yàn)椋杭铀拷M合＞豆粕前處理方法＞菌種組合，以提高賴(lài)氨酸含量為目標(biāo)的優(yōu)化工藝組合為A1B3C1；試驗(yàn)因素對(duì)蛋氨酸影響力排序與賴(lài)氨酸結(jié)果相同，但以提高蛋氨酸含量為目標(biāo)的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A3B1C3；試驗(yàn)因素對(duì)精氨酸影響力排序?yàn)榫N組合＞豆粕前處理方法＞加水量組合，以提高精氨酸含量為目標(biāo)的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A1B2C2；對(duì)蘇氨酸而言，各因素水平間沒(méi)有顯著差異，以提高含量為目標(biāo)的工藝優(yōu)化參數(shù)組合為A3B1C3。

對(duì)于蛋白質(zhì)水解度而言，發(fā)酵階段與試驗(yàn)因素存在互作，在不同的發(fā)酵階段試驗(yàn)因素影響力排序和工藝組合參數(shù)不同。好氧發(fā)酵階段的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A3B3C3，好氧加厭氧1周發(fā)酵階段優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A3B1C3，而試驗(yàn)全程的優(yōu)化工藝參數(shù)組合為A3B1C3。

3.2 關(guān)于水解度與各指標(biāo)之間的相關(guān)與回歸關(guān)系

蛋白質(zhì)水解度與揮發(fā)性鹽基總氮存在高度的正相關(guān)，與賴(lài)氨酸和精氨酸含量存在高度負(fù)相關(guān)，且在好氧發(fā)酵階段和試驗(yàn)全程表現(xiàn)一致；與蛋氨酸、（蛋+胱）氨酸表現(xiàn)基本一致，即好氧階段相關(guān)性很低，試驗(yàn)全程則高度正相關(guān)；對(duì)蘇氨酸的相關(guān)性則好氧發(fā)酵階段為負(fù)，試驗(yàn)全程為正相關(guān)。具體的相關(guān)系數(shù)列于表5中，可依此判斷隨發(fā)酵深度提高，各指標(biāo)變動(dòng)的方向趨勢(shì)。

蛋白質(zhì)水解度與揮發(fā)性鹽基氮、賴(lài)氨酸、精氨酸含量均呈現(xiàn)極顯著的線(xiàn)性回歸關(guān)系；與蘇氨酸含量呈極顯著的二次回歸關(guān)系，與蛋氨酸和（蛋+胱）氨酸均呈現(xiàn)極顯著的三次回歸關(guān)系。具體的回歸曲線(xiàn)估計(jì)參數(shù)均列于表6中，可依此使用蛋白質(zhì)水解度估計(jì)其他指標(biāo)的含量。

3.3 需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題

對(duì)于不同指標(biāo)優(yōu)化工藝組合參數(shù)的結(jié)果是不同的，例如提高蛋白質(zhì)水解度和降低鹽基氮含量的組合是相反的，因此用飼養(yǎng)試驗(yàn)效果確定適宜的蛋白質(zhì)水解度標(biāo)準(zhǔn)是非常重要的，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究抑制賴(lài)氨酸、精氨酸和蘇氨酸的降解和鹽基氮含量的累積將是提高發(fā)酵豆粕品質(zhì)的重要研究?jī)?nèi)容。

不同發(fā)酵階段和試驗(yàn)因素之間存在互作關(guān)系，例如好氧發(fā)酵過(guò)程中料坯的厚度影響底層的供氧量，并影響到蛋白質(zhì)水解的速度，導(dǎo)致其與鹽基氮含量關(guān)系的變化?；蛘哒f(shuō)采用不同的發(fā)酵工藝會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解度與各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)或回歸方程式的不同。因此要確定適宜的回歸關(guān)系，應(yīng)在確定具體的發(fā)酵工藝各參數(shù)后進(jìn)行特定的研究，其結(jié)果則具有實(shí)際指導(dǎo)固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)措施和方法的重要意義。

[1]張麗英,等.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)（第二版）[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2005,7：116-120.

[2]寧正祥.食品成分分析手冊(cè)（第一版）[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2001：546-547.

[3]寧正祥.食品成分分析手冊(cè)（第一版）[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2001：120-121.