李玲 ，冷新麗 ，胡婧 ，郭麗茹 ，楊玉英

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，天津 300384；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

克雷伯氏菌屬（Klebsiella）為革蘭氏陰性，兼性厭氧桿菌。該菌屬腸桿菌科克雷伯菌屬[1]。主要有肺炎克雷伯氏菌（K.peneumoniae）、臭鼻克雷伯氏菌（K.ozaenae）和鼻硬結(jié)克雷伯氏菌（K.rhinoscleromatis）。生物學(xué)性狀為較短粗的桿菌，大小0.5～0.8×1～2 um，單獨、成雙或短鏈狀排列。無芽胞，無鞭毛，有較厚的莢膜，多數(shù)有菌毛。營養(yǎng)要求不高，有普通瓊脂培養(yǎng)基上形成較大的灰白色粘液菌落。本屬細(xì)菌55℃30min被殺死。在培養(yǎng)基上可存活數(shù)周至數(shù)月。

臭鼻克雷伯氏菌簡稱臭鼻桿菌，一般情況下臭鼻克雷伯氏菌不致病，屬于條件致病菌。引起慢性萎縮性鼻炎，有惡臭，以及敗血癥、泌尿系感染等。

通過對市售的雞蛋進(jìn)行微生物學(xué)鑒定，對雞蛋進(jìn)行了細(xì)菌的分離、培養(yǎng)及生化鑒定。結(jié)果從雞蛋中分離到一株革蘭氏陰性桿菌，菌體呈短粗形，典型排列為單獨、成雙或短鏈狀排列，兼性厭氧菌，在血瓊脂上生長，菌落周圍形成α型溶血。經(jīng)鑒定該菌為臭鼻克雷伯氏菌。以前未見從雞蛋中分離出臭鼻克雷伯氏菌的報道。同時對該菌在營養(yǎng)瓊脂、麥康凱和伊紅美蘭培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其在不同培養(yǎng)基上的生長特性。

1 材料

1.1 試劑

生化管、購自杭州天和微生物試劑有限公司，生理鹽水、革蘭氏染液、培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備。

1.2 藥敏紙片

購自杭州天和微生物試劑有限公司（各種藥物敏感標(biāo)準(zhǔn)由杭州天和微生物試劑有限公司提供）。

1.3 實驗動物

體重18～22 g健康小白鼠（購自牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心）。

2 方法

2.1 樣品的采集

從某超市銷售雞蛋的蛋筐下層無菌采集樣品蛋（2010年3月10日）。

2.2 樣品的處理

雞蛋標(biāo)號，倒出蛋內(nèi)容物，取下蛋殼膜，將蛋殼碾成粉末，雞蛋內(nèi)容物充分?jǐn)嚢杈鶆?。?.5 g蛋殼粉，1mL雞蛋內(nèi)容物分別放于消毒青霉素瓶內(nèi)，按10倍、100倍、1000倍、10000倍的稀釋度，將上述樣品用無菌生理鹽水稀釋。

2.3 細(xì)菌的培養(yǎng)

每個稀釋度吸取0.1mL均勻涂布于鮮血瓊脂平板上，置37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)結(jié)果。

2.4 細(xì)菌的分離純化及培養(yǎng)特性試驗

用接種環(huán)分別從細(xì)菌形態(tài)不一致的單個具有代表性的菌落挑起少許革蘭氏染色，根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭氏染色，將剩余部分接種于血平板，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。再將純化的培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)瓊脂、麥康凱和伊紅美蘭培養(yǎng)基上37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

2.5 涂片、染色、鏡檢

將分離純化的細(xì)菌制成菌液凃片，進(jìn)行革蘭氏染色法染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)。

2.6 生化試驗

取上述純化菌分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素等生化鑒定管，培養(yǎng)特性及生化特性鑒定，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。生化特性鑒定試驗按參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。

2.7 動物感染試驗

用無菌生理鹽水將瓊脂板上純化的菌落洗下后，以每只0.5mL腹腔注射小白鼠2只，同時以滅菌生理鹽水注射兩只小白鼠作為對照，分別飼養(yǎng)觀察其癥狀，對感染試驗出現(xiàn)癥狀或死亡的小白鼠進(jìn)行剖檢，并采集病料進(jìn)行分離。

2.8 藥敏試驗

用生理鹽水將菌落洗下，制成菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在營養(yǎng)基表面，置37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 培養(yǎng)特性觀察

經(jīng)培養(yǎng)蛋殼上未見該菌，蛋內(nèi)容物里該菌對營養(yǎng)要求不高，在37℃條件下，需氧和厭氧培養(yǎng)的普通瓊脂平板上長出較大的灰白色粘液狀菌落，用接種環(huán)挑菌落，易拉成絲；在鮮血瓊脂平板上，菌落周圍形成α型溶血。

3.2 鏡檢結(jié)果

顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性、較短粗的桿菌，單獨、成雙或短鏈狀排列。無芽胞，無鞭毛，有較厚的莢膜，多數(shù)有菌毛。

3.3 生化鑒定結(jié)果

對分離菌進(jìn)行生化試驗，結(jié)果如表1所示，該菌的生化反應(yīng)結(jié)果符合臭鼻克雷伯氏菌的生化特性。

表1 菌株的生化鑒定結(jié)果Table 1 The Results of the Biochemical Identifying Features of Klebsiella Ozaenae

根據(jù)該菌株的菌落形態(tài)、大小、培養(yǎng)特性、生化試驗等結(jié)果，對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第八版》所描述有關(guān)臭鼻克雷伯氏菌的特征，確定該分離菌為臭鼻克雷伯氏菌。

3.4 動物感染試驗

只注射生理鹽水的小白鼠沒有任何變化；接種分離菌的小白鼠死亡。將上述死亡的小白鼠剖檢采取病理，進(jìn)行細(xì)菌分離和生化試驗，能得到原分離菌。

3.5 藥敏試驗結(jié)果

將臭鼻克雷伯氏菌均勻接種在普通培養(yǎng)基上，將藥敏片按一定距離貼好，在37℃培養(yǎng)24 h，分離細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果如表2所示。

表2 分離細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果Table 2 The Results of drug sensitivity tests of Klebsiella Ozaenae

4 討論

食品蛋內(nèi)外所帶的微生物來源有二個途徑：一是有些母雞不健康，生殖器官的殺菌作用減弱，來自腸道或肛門中的微生物可以侵入輸卵管，能最后污染食品蛋；二是雞蛋經(jīng)過泄殖腔排出體外受糞便污染，排出體外后，由于貯存運(yùn)輸、銷售等環(huán)境不衛(wèi)生受到微生物污染[3，4]。而且食品蛋經(jīng)過一定的貯存溫度和時間后，微生物可通過蛋殼上無數(shù)的氣孔進(jìn)入。雞蛋雖然對微生物的侵入有一定自衛(wèi)能力，但是隨著貯存時間延長，溫度變化，這種能力逐漸減弱。最后有毒有害的微生物侵入蛋內(nèi)而得以繁殖[5，6]。蛋所攜帶的微生物有金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏桿菌等[7]。

實驗首次從雞蛋中分離出臭鼻克雷伯氏菌。臭鼻克雷伯氏菌分布于自然界，存在于水和土壤中，是一種條件致病菌，一般情況下臭鼻克雷伯氏菌不致病，發(fā)病與寄主防御功能缺陷及誘發(fā)因素有關(guān)，可引發(fā)慢性萎縮性鼻炎，有惡臭，以及敗血癥、泌尿系感染等。其易感性因素有：①各種降低免疫功能的慢性病，如慢性支氣管炎、肝硬變、糖尿病和惡性腫瘤等。②腎上腺皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑的應(yīng)用。③廣譜抗生素的使用致正常菌群變化。④各種器械操作和創(chuàng)傷性診療技術(shù)（如各種導(dǎo)管、氣管切開等，為細(xì)菌入侵創(chuàng)造了條件）[8]。在不利的飼養(yǎng)管理條件下，如雞群擁擠，雞舍潮濕，糞便清理不及時，加上春季氣溫轉(zhuǎn)暖，通風(fēng)換氣不良都是導(dǎo)致發(fā)生此病的因素。應(yīng)引起有關(guān)部門的重視，特別是醫(yī)藥衛(wèi)生部門，避免蛋源性細(xì)菌感染的發(fā)生。

［1］陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［2］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌鑒定手冊［M］.科技出版社，2001.

［3］李曉東.蛋品科學(xué)與技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［4］周永昌.蛋與蛋制品工藝學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1994.

［5］Humphrey JJ.Contamination of egg shell and contents with salmonella enteritidis［J］.Food Microbil，1994，21:31-40.

［6］王紅寧，馬孟根，魏永，等.規(guī)模化雞場種蛋蛋殼、雞蛋內(nèi)容物的總細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、沙門氏菌數(shù)測定［J］.中國家禽，2001，24（23）:9-11.

［7］Humphrey T J，Greenwood M，Gilbert R J，et al.The sur2vival of Salmonellas in shell eggs cooked under simulated domestic conditions ［J］.Epidemiology and Infection，1989，103:35-45.

［8］譚紅專.現(xiàn)代流行病學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.