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        雞蛋中臭鼻克雷伯氏菌的分離與鑒定

        2011-06-08 05:09:06李玲冷新麗胡婧郭麗茹楊玉英
        關(guān)鍵詞:氏菌小白鼠克雷伯

        李玲 ,冷新麗 ,胡婧 ,郭麗茹 ,楊玉英

        (1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系,天津 300384;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院)

        克雷伯氏菌屬(Klebsiella)為革蘭氏陰性,兼性厭氧桿菌。該菌屬腸桿菌科克雷伯菌屬[1]。主要有肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬結(jié)克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。生物學(xué)性狀為較短粗的桿菌,大小0.5~0.8×1~2 um,單獨、成雙或短鏈狀排列。無芽胞,無鞭毛,有較厚的莢膜,多數(shù)有菌毛。營養(yǎng)要求不高,有普通瓊脂培養(yǎng)基上形成較大的灰白色粘液菌落。本屬細(xì)菌55℃30min被殺死。在培養(yǎng)基上可存活數(shù)周至數(shù)月。

        臭鼻克雷伯氏菌簡稱臭鼻桿菌,一般情況下臭鼻克雷伯氏菌不致病,屬于條件致病菌。引起慢性萎縮性鼻炎,有惡臭,以及敗血癥、泌尿系感染等。

        通過對市售的雞蛋進(jìn)行微生物學(xué)鑒定,對雞蛋進(jìn)行了細(xì)菌的分離、培養(yǎng)及生化鑒定。結(jié)果從雞蛋中分離到一株革蘭氏陰性桿菌,菌體呈短粗形,典型排列為單獨、成雙或短鏈狀排列,兼性厭氧菌,在血瓊脂上生長,菌落周圍形成α型溶血。經(jīng)鑒定該菌為臭鼻克雷伯氏菌。以前未見從雞蛋中分離出臭鼻克雷伯氏菌的報道。同時對該菌在營養(yǎng)瓊脂、麥康凱和伊紅美蘭培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),觀察其在不同培養(yǎng)基上的生長特性。

        1 材料

        1.1 試劑

        生化管、購自杭州天和微生物試劑有限公司,生理鹽水、革蘭氏染液、培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備。

        1.2 藥敏紙片

        購自杭州天和微生物試劑有限公司(各種藥物敏感標(biāo)準(zhǔn)由杭州天和微生物試劑有限公司提供)。

        1.3 實驗動物

        體重18~22 g健康小白鼠(購自牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)。

        2 方法

        2.1 樣品的采集

        從某超市銷售雞蛋的蛋筐下層無菌采集樣品蛋(2010年3月10日)。

        2.2 樣品的處理

        雞蛋標(biāo)號,倒出蛋內(nèi)容物,取下蛋殼膜,將蛋殼碾成粉末,雞蛋內(nèi)容物充分?jǐn)嚢杈鶆?。?.5 g蛋殼粉,1mL雞蛋內(nèi)容物分別放于消毒青霉素瓶內(nèi),按10倍、100倍、1000倍、10000倍的稀釋度,將上述樣品用無菌生理鹽水稀釋。

        2.3 細(xì)菌的培養(yǎng)

        每個稀釋度吸取0.1mL均勻涂布于鮮血瓊脂平板上,置37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)結(jié)果。

        2.4 細(xì)菌的分離純化及培養(yǎng)特性試驗

        用接種環(huán)分別從細(xì)菌形態(tài)不一致的單個具有代表性的菌落挑起少許革蘭氏染色,根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭氏染色,將剩余部分接種于血平板,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。再將純化的培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)瓊脂、麥康凱和伊紅美蘭培養(yǎng)基上37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。

        2.5 涂片、染色、鏡檢

        將分離純化的細(xì)菌制成菌液凃片,進(jìn)行革蘭氏染色法染色,鏡檢觀察菌體形態(tài)。

        2.6 生化試驗

        取上述純化菌分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素等生化鑒定管,培養(yǎng)特性及生化特性鑒定,37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。生化特性鑒定試驗按參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。

        2.7 動物感染試驗

        用無菌生理鹽水將瓊脂板上純化的菌落洗下后,以每只0.5mL腹腔注射小白鼠2只,同時以滅菌生理鹽水注射兩只小白鼠作為對照,分別飼養(yǎng)觀察其癥狀,對感染試驗出現(xiàn)癥狀或死亡的小白鼠進(jìn)行剖檢,并采集病料進(jìn)行分離。

        2.8 藥敏試驗

        用生理鹽水將菌落洗下,制成菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上,用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在營養(yǎng)基表面,置37℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。

        3 結(jié)果

        3.1 培養(yǎng)特性觀察

        經(jīng)培養(yǎng)蛋殼上未見該菌,蛋內(nèi)容物里該菌對營養(yǎng)要求不高,在37℃條件下,需氧和厭氧培養(yǎng)的普通瓊脂平板上長出較大的灰白色粘液狀菌落,用接種環(huán)挑菌落,易拉成絲;在鮮血瓊脂平板上,菌落周圍形成α型溶血。

        3.2 鏡檢結(jié)果

        顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性、較短粗的桿菌,單獨、成雙或短鏈狀排列。無芽胞,無鞭毛,有較厚的莢膜,多數(shù)有菌毛。

        3.3 生化鑒定結(jié)果

        對分離菌進(jìn)行生化試驗,結(jié)果如表1所示,該菌的生化反應(yīng)結(jié)果符合臭鼻克雷伯氏菌的生化特性。

        表1 菌株的生化鑒定結(jié)果Table 1 The Results of the Biochemical Identifying Features of Klebsiella Ozaenae

        根據(jù)該菌株的菌落形態(tài)、大小、培養(yǎng)特性、生化試驗等結(jié)果,對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第八版》所描述有關(guān)臭鼻克雷伯氏菌的特征,確定該分離菌為臭鼻克雷伯氏菌。

        3.4 動物感染試驗

        只注射生理鹽水的小白鼠沒有任何變化;接種分離菌的小白鼠死亡。將上述死亡的小白鼠剖檢采取病理,進(jìn)行細(xì)菌分離和生化試驗,能得到原分離菌。

        3.5 藥敏試驗結(jié)果

        將臭鼻克雷伯氏菌均勻接種在普通培養(yǎng)基上,將藥敏片按一定距離貼好,在37℃培養(yǎng)24 h,分離細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果如表2所示。

        表2 分離細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果Table 2 The Results of drug sensitivity tests of Klebsiella Ozaenae

        4 討論

        食品蛋內(nèi)外所帶的微生物來源有二個途徑:一是有些母雞不健康,生殖器官的殺菌作用減弱,來自腸道或肛門中的微生物可以侵入輸卵管,能最后污染食品蛋;二是雞蛋經(jīng)過泄殖腔排出體外受糞便污染,排出體外后,由于貯存運(yùn)輸、銷售等環(huán)境不衛(wèi)生受到微生物污染[3,4]。而且食品蛋經(jīng)過一定的貯存溫度和時間后,微生物可通過蛋殼上無數(shù)的氣孔進(jìn)入。雞蛋雖然對微生物的侵入有一定自衛(wèi)能力,但是隨著貯存時間延長,溫度變化,這種能力逐漸減弱。最后有毒有害的微生物侵入蛋內(nèi)而得以繁殖[5,6]。蛋所攜帶的微生物有金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏桿菌等[7]。

        實驗首次從雞蛋中分離出臭鼻克雷伯氏菌。臭鼻克雷伯氏菌分布于自然界,存在于水和土壤中,是一種條件致病菌,一般情況下臭鼻克雷伯氏菌不致病,發(fā)病與寄主防御功能缺陷及誘發(fā)因素有關(guān),可引發(fā)慢性萎縮性鼻炎,有惡臭,以及敗血癥、泌尿系感染等。其易感性因素有:①各種降低免疫功能的慢性病,如慢性支氣管炎、肝硬變、糖尿病和惡性腫瘤等。②腎上腺皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑的應(yīng)用。③廣譜抗生素的使用致正常菌群變化。④各種器械操作和創(chuàng)傷性診療技術(shù)(如各種導(dǎo)管、氣管切開等,為細(xì)菌入侵創(chuàng)造了條件)[8]。在不利的飼養(yǎng)管理條件下,如雞群擁擠,雞舍潮濕,糞便清理不及時,加上春季氣溫轉(zhuǎn)暖,通風(fēng)換氣不良都是導(dǎo)致發(fā)生此病的因素。應(yīng)引起有關(guān)部門的重視,特別是醫(yī)藥衛(wèi)生部門,避免蛋源性細(xì)菌感染的發(fā)生。

        [1]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001.

        [2]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌鑒定手冊[M].科技出版社,2001.

        [3]李曉東.蛋品科學(xué)與技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

        [4]周永昌.蛋與蛋制品工藝學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1994.

        [5]Humphrey JJ.Contamination of egg shell and contents with salmonella enteritidis[J].Food Microbil,1994,21:31-40.

        [6]王紅寧,馬孟根,魏永,等.規(guī)模化雞場種蛋蛋殼、雞蛋內(nèi)容物的總細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、沙門氏菌數(shù)測定[J].中國家禽,2001,24(23):9-11.

        [7]Humphrey T J,Greenwood M,Gilbert R J,et al.The sur2vival of Salmonellas in shell eggs cooked under simulated domestic conditions [J].Epidemiology and Infection,1989,103:35-45.

        [8]譚紅專.現(xiàn)代流行病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.

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