劉素杰 趙大偉 張 卓

（吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

CIK是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外多種細(xì)胞因子（如抗CD3McAb、IL-1a、IL-2、IFN-γ）刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞[1]。乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，乳腺癌的生物治療是繼手術(shù)、放化療之外的又一項(xiàng)治療手段。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比研究健康人與乳腺癌患者兩種不同來(lái)源的CIK增殖能力及活性，進(jìn)一步探討CIK細(xì)胞的抗腫瘤作用，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

健康人外周血樣本10例，年齡27～56歲，樣本來(lái)自吉林省腫瘤醫(yī)院體檢中心。乳腺癌患者外周血樣本10例，年齡39～58歲，樣本來(lái)自吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺二科，全部病例均經(jīng)病理證實(shí)。

1.2 主要試劑

CD3單克隆抗體（北京邦定公司）；IL-1a、IL-2、IFN-γ（Strthmann Biotech GmbH，Germany），MTT（美國(guó)Sigma公司）。

1.3 方法

1.3.1 CIK細(xì)胞制備及擴(kuò)增

兩種不同來(lái)源地外周末梢血血樣，利用Isopaque離心法密度梯度分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），加入RPMI1640培養(yǎng)液，10%胎牛血清培養(yǎng)，加入100μg/mL，重組IFN-γ孵育24h后，再加入50μg/mLCD3McAb，100u/mL人重組IL-1a，300u/mLIL-2放置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞每隔2d傳代培養(yǎng)。

1.3.2 CIK細(xì)胞的增殖測(cè)定

動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞增殖，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.3.3 MTT法檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞株殺傷活性

培養(yǎng)14d的CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，分別與乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7）、肝癌細(xì)胞株（SMMC-7721）、肺癌細(xì)胞株（SPC-A-1）3種靶細(xì)胞混合，按50∶1效靶比加入96孔板，每組3復(fù)孔。另設(shè)單獨(dú)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞組，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)48h，離心棄上清，每孔加二甲基亞砜150μL，振蕩溶解10min后，用酶標(biāo)儀570nm測(cè)OD值，計(jì)算CIK的殺瘤活性。殺傷活性（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值）/靶細(xì)胞OD值]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，健康人與乳腺癌患者CIK細(xì)胞對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的抑瘤比較，采用成組比較t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 CIK細(xì)胞在培養(yǎng)第3天開(kāi)始出現(xiàn)增殖，至第21天增殖100余倍；乳腺癌患者來(lái)源的CIK細(xì)胞的增殖速度慢于健康人CIK細(xì)胞（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 健康人與乳腺癌患者CIK細(xì)胞體外增殖力對(duì)比[（±s），n=10]

表1 健康人與乳腺癌患者CIK細(xì)胞體外增殖力對(duì)比[（±s），n=10]

注：*與健康人相比P＜0.05

組別 CIK細(xì)胞增殖能力1d 7d 14d 21d健康人 1.05±0.04 31.25±2.74 89.90±4.83 176.82±14.62乳腺癌患者 1.03±0.07 19.33±1.42* 55.09±7.85* 107.68±15.36*

2.2 健康人與乳腺癌患者CIK細(xì)胞對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的抑瘤比較

乳腺癌患者CIK細(xì)胞對(duì)3種腫瘤細(xì)胞殺傷活性明顯低于健康人CIK細(xì)胞（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 健康人與乳腺癌患者CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性（%）

3 討 論

隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)等研究的進(jìn)展，乳腺癌的治療已經(jīng)由傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療治療模式向包括內(nèi)分泌治療、生物免疫治療和基因治療在內(nèi)的綜合治療模式轉(zhuǎn)變[2]。CIK細(xì)胞生物治療的手段之一。CIK細(xì)胞是由血液或骨髓單個(gè)核細(xì)胞在體外與多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)獲得，由于多種細(xì)胞因子之間的協(xié)同作用，使其具備殺傷活性對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制生長(zhǎng)作用[3-5]。本研究將健康人和乳腺癌患者的PBMC在同等條件下誘導(dǎo)CIK細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，健康人來(lái)源的CIK細(xì)胞其增殖率及殺傷活性均高于乳腺癌患者來(lái)源的CIK細(xì)胞。健康人來(lái)源CIK細(xì)胞對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株均有不同程度殺傷。這種差異可能是腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤患者免疫效應(yīng)細(xì)胞功能影響所致，腫瘤微環(huán)境常呈現(xiàn)酸性，可強(qiáng)烈抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的增生作用，細(xì)胞毒作用和代謝活性[6,7]。在臨床應(yīng)用中可以根據(jù)CIK細(xì)胞來(lái)源的不同及患者具體情況，選擇不同來(lái)源地CIK細(xì)胞進(jìn)行治療。

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