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        反相高效液相色譜法測(cè)定瘤胃液中的生物胺

        2011-06-06 10:39:08王東升霍文婕朱偉云毛勝勇
        關(guān)鍵詞:色胺酪胺甲胺

        王東升 霍文婕 朱偉云 毛勝勇

        (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,南京 210095)

        生物胺(biogenic amine,BA)是脂肪族、芳香族或雜環(huán)族的低分子質(zhì)量有機(jī)堿,常存在于動(dòng)植體內(nèi)及食品中[1]。反芻動(dòng)物瘤胃液中的生物胺主要是由瘤胃液中相關(guān)微生物產(chǎn)生的酶或飼料原料中固有的酶催化瘤胃液中游離氨基酸脫羧基生成[2]。正常狀態(tài)下,瘤胃液中生物胺濃度很低,但當(dāng)動(dòng)物攝入的蛋白質(zhì)或可發(fā)酵碳水化合物大量增加時(shí),瘤胃液中的生物胺濃度會(huì)增加,進(jìn)而致宿主出現(xiàn)一系列疾病,如蹄葉炎等[3]。因此,建立瘤胃液中生物胺的檢測(cè)方法,對(duì)于了解瘤胃內(nèi)生物胺的生成規(guī)律具有重要意義。

        盡管目前已有多種方法應(yīng)用于食品生物胺的測(cè)定,如:薄層色譜(TLC)、毛細(xì)管電泳(cE)、氣相色譜(GC)以及基于生物傳感器的方法等[1,4],但有關(guān)瘤胃液中生物胺的檢測(cè)方法的報(bào)道很少,并且多為僅針對(duì)于某一類生物胺,如組胺或色胺等。實(shí)際上,瘤胃液中還可能存在腐胺、尸胺等源于氨基酸的異常代謝產(chǎn)物,而這些物質(zhì)也會(huì)對(duì)宿主健康帶來(lái)危害[3]。由此,為進(jìn)一步了解瘤胃內(nèi)生物胺的生成規(guī)律,本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法,建立瘤胃液生物胺的測(cè)定方法,擬為深入探討瘤胃內(nèi)氨基酸的代謝及生物胺的生成規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試劑和樣品

        色胺(tryptamine,TRY)、腐 胺(putrescine,PUT)、甲胺(methylamine,MET)、組胺(histamine,HIS)、酪胺(tyramine,TYR)、丹磺酰氯(dansyl chloride)均購(gòu)自Sigma公司。乙腈、乙酸銨和丙酮為色譜純;鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、冰乙酸為分析純;超純水(Milli-Q,Millipore公司)在實(shí)驗(yàn)室制備。瘤胃液采自飼喂精粗比為1∶9和7∶3的6頭長(zhǎng)江三角洲白山羊(雄性),飼糧精飼料由70%玉米和30%豆粕組成,粗飼料由70%苜蓿和30%羊草組成。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        準(zhǔn)確稱取色胺 16.0 mg、腐胺 16.1 mg、組胺11.1 mg、酪 胺 13.7 mg、甲胺 6.75 mg,用0.5 mol/L的鹽酸定容至10 mL,制成10 mol/L儲(chǔ)備液備用。分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,用0.5 mol/L鹽酸配制成終濃度分別為10、100、1 000 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用鋁箔紙避光、-25℃保存。

        1.2.2 樣品處理

        取 100 μL 待測(cè)樣品加入150 μL 的0.5 mol/L的鹽酸,渦旋混勻后4℃下13 000 r/min離心10 min,沉淀部分如上述方法再提取1次。取2次的上清液用0.5 mol/L的鹽酸定容到10 mL。

        1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的衍生化

        分別取上述的生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液200 μL,加入 100 μL 的飽和碳酸氫鈉溶液(用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=11)進(jìn)行緩沖,再加入100 μL的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(10 g/L,丙酮為溶劑),然后置于60℃水浴中、黑暗條件下反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL的1%冰乙酸。衍生處理后,4℃下13 000 r/min離心10 min后取上清液待測(cè)[5]。

        1.2.4 儀器設(shè)備

        島津液相色譜系統(tǒng)(LC-10ATVP)。

        1.2.5 色譜條件

        色譜柱為Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm),流速為1 mL/min,紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為 260 nm,進(jìn)樣量20 μL,柱溫30℃,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為乙酸銨溶液,采用梯度洗脫,程序見(jiàn)表1。

        1.2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

        取新鮮樣品,按照1.2.2方法處理樣品,取200 μL樣品加入5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,使之相當(dāng)于各添加125和250 μmol/L的濃度,3次重復(fù)試驗(yàn),扣除樣品中空白試驗(yàn)生物胺的濃度,求得其回收率。

        1.2.7 不同精粗比飼糧對(duì)山羊瘤胃液中生物胺濃度的影響

        受試動(dòng)物為6頭裝有永久性瘤胃瘺管、體況良好的雄性長(zhǎng)江三角洲白山羊,單欄飼喂,自由飲水。受試動(dòng)物隨機(jī)分為2組,分別飼喂精粗比為1∶9(日飼喂精飼料 100 g,粗飼料900 g)和 7∶3(日飼喂精飼料700 g,粗飼料300 g)的飼糧。精飼料和粗飼料組成與1.1中相同。于08:00和20:00分2次等量飼喂。

        適應(yīng)飼糧 18 d后,于第 19、20、21天飼喂(08:00)前采集瘤胃液,用于初步研究2種飼糧精粗比條件下飼喂前瘤胃液中5種生物胺的差異。

        表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedures

        1.3 統(tǒng)計(jì)分析

        數(shù)據(jù)采用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著性水平置于 0.05。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 保留時(shí)間

        本試驗(yàn)采用乙腈和水為流動(dòng)相,并采用表1所示的梯度程序洗脫。在使用單標(biāo)確定保留時(shí)間(表2)的基礎(chǔ)上,將5種單標(biāo)混合,取混合的混標(biāo)進(jìn)行色譜分離,由圖1、圖2可見(jiàn),5種胺在40 min內(nèi)能得到很好分離,且峰形對(duì)稱,沒(méi)有拖尾等現(xiàn)象。

        表2 5種生物胺的保留時(shí)間Table 2 Retention time of the five biogenic amines

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

        將標(biāo)準(zhǔn)溶液依次以10、100和1 000 μmol/L進(jìn)樣,所得峰面積對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù),結(jié)果見(jiàn)表3。本方法的檢出限是以信噪比(S/N)大于3作為判斷標(biāo)準(zhǔn),色胺的檢測(cè)限為10.0 μmol/L,甲胺的檢測(cè)限為 1.2 μmol/L,其余3 種胺的檢測(cè)限都為 1.0 μmol/L。

        圖1 生物胺混標(biāo)色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of biogenic amine

        圖2 瘤胃液生物胺色譜圖Fig.2 Chromatogram of biogenic amine in rumen liquid

        2.3 回收率測(cè)定

        由表4可知,5種生物胺的平均回收率如下:酪胺 94.97%、腐胺 95.54%、組胺 93.48%、甲胺92.90%、色胺 93.00%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10%,可見(jiàn)該方法可滿足檢測(cè)的需要。

        2.4 飼糧精粗比對(duì)瘤胃液5種生物胺的影響

        由表5可見(jiàn),在2種飼糧精粗比條件下,高精料瘤胃液中酪胺與甲胺濃度均顯著高于低精料組(P<0.05),但二者間在腐胺、組胺及色胺濃度上無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

        表3 生物胺的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限Table 3 Regression equation,correlation coefficient square and the detectability of biogenic amine

        表4 本試驗(yàn)方法的回收率Table 4 Average recovery of the method in the present study

        表5 飼糧精粗比對(duì)瘤胃液中5種生物胺濃度的影響Table 5 Effects of dietary forage-to-concentrate ratio on concentrations of the five biogenic amines in rumen liquid μmol/L

        3 討論

        生物胺是一類含氮低分子化合物,對(duì)動(dòng)植物和微生物有重要的生理作用。適量的生物胺有助于動(dòng)物機(jī)體正常的生理功能,過(guò)量則會(huì)引起不良生理反應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)瘤胃內(nèi)生物胺的檢測(cè)主要采用液相色譜法,一般僅針對(duì)組胺[6]。實(shí)際上瘤胃中還含有其他的生物胺(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、尸胺、甲胺等),且其存在會(huì)對(duì)組胺的毒性有協(xié)同作用[3,8-9]。因此,多組分生物胺的同時(shí)檢測(cè)對(duì)于了解瘤胃微生物對(duì)氨基酸的代謝以及研究瘤胃健康具有重要生物學(xué)意義。

        本試驗(yàn)結(jié)果表明,采用丹磺酰氯柱前衍生方法,應(yīng)用紫外檢測(cè)器能夠滿足分析檢測(cè)瘤胃液中生物胺的需求,瘤胃液中色胺、腐胺、甲胺、組胺、酪胺5種生物胺能在40 min內(nèi)得到很好分離。除了酪胺外,其他生物胺的線性范圍為10~1 000 μmol/L(R2>0.99),該方法的平均回收率分別為色胺 93.00%、腐 胺 95.54%、甲 胺92.90%、組胺 93.48%、酪胺 94.47%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。結(jié)果說(shuō)明采用該方法可用于分析瘤胃液中的生物胺,同時(shí)分離效果好,完全滿足瘤胃液中生物胺的檢測(cè)需要。

        由于我國(guó)粗飼料資源相對(duì)有限,而生產(chǎn)者過(guò)度追求經(jīng)濟(jì)效益,在奶牛生產(chǎn)中使用了大量的精飼料,雖其結(jié)果會(huì)提高奶牛的產(chǎn)奶性能,但奶牛的消化代謝疾病明顯增多,使用壽命大大縮短,給畜牧生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[10]。相關(guān)報(bào)道表明,奶牛飼糧中精飼料比例過(guò)高時(shí),奶牛瘤胃內(nèi)常發(fā)生急性酸中毒,瘤胃內(nèi)乳酸累積,進(jìn)而引起酸中毒而死亡,而在慢性酸中毒情況下,瘤胃內(nèi)異常代謝產(chǎn)物如組胺和內(nèi)毒素等均會(huì)大量增加,使奶牛繼發(fā)其他疾?。?1-13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,高精料飼糧條件下,山羊瘤胃液中酪胺和甲胺濃度遠(yuǎn)高于低精料飼糧,提示飼糧精粗比對(duì)瘤胃內(nèi)生物胺的濃度具有較明顯的影響。但本試驗(yàn)中,筆者未發(fā)現(xiàn)飼糧精粗比對(duì)瘤胃液中組胺、色胺和腐胺濃度的影響,可能與采樣的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)系,本試驗(yàn)僅初步研究了飼喂前瘤胃液中5種生物胺的差異,而飼喂后瘤胃內(nèi)5種生物胺是如何變化的?飼糧精粗比對(duì)這5種生物胺濃度有何影響?目前尚不清楚,需進(jìn)一步研究。

        4 結(jié)論

        ①本試驗(yàn)建立了反相高效液相色譜法測(cè)定瘤胃液中的5種生物胺的方法。

        ②飼糧精粗比可影響瘤胃液中生物胺濃度,高精料飼糧條件下瘤胃液中酪胺和甲胺濃度顯著增加。

        [1]蔡成崗,張慧,王智敏,等.食品中生物胺及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2009(10):153-156.

        [2]WIEBKE E,ANNETTE Z,KLAUS D,et al.LC analysis of histamine and other biogenic amines in digesta cultures[J]. Chromatographia,2009,70:1207-1213.

        [3]NAGARAJA T G,TITGEMEYER E C.Ruminal acidosis in beef cattle:the current microbiological and nutritional outlook[J].Journal of Dairy Science,2007,90:17-38.

        [4]范春艷,孔維府,潘秋紅,等.葡萄酒中8種生物胺的RP-HPLC檢測(cè)方法的研究[J].中國(guó)釀造,2010(11):168-171.

        [5]屠春燕,袁艷娟,吳燕嬌,等.對(duì)甲氧基苯磺酰氯柱前衍生生物胺的高效液相色譜分離[J].分析試驗(yàn)室,2010(3):96-100.

        [6]PILACHAIR,SCHONEWILLEJT,THAMRONGYOSWITTAYAKUL C,et al.The effects of high levels of rumen degradable protein on rumen pH and histamine concentrations in dairy cows[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition,doi:10.1111/j.1439-0396.2011.01139.x.

        [7]DAIN J A,NEAL A,DOUGHERTY R W.The occurrence of histamine and tyramine in rumen ingesta of experimentally overfed sheep[J].Journal of Animal Science,1955,14:930-935.

        [8]IRWIN L N,MITCHELL G E,Jr.,TUCKER R E,et al.Occurence and disappearance of ruminal histamine and tyramine[J].Journal of Animal Science,1979,48(6):1470-1474.

        [9]ASCHENBACH J R,G?BEL G.Effect and absorption of histamine in sheep rumen:significance of acidotic epithelial damage[J].Journal of Animal Science,2000,78(2):464-470.

        [10]胡紅蓮,盧德勛,劉大程,等.日糧不同NFC/NDF比對(duì)奶山羊瘤胃pH、揮發(fā)性脂肪酸及乳酸含量的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22(3):595-601.

        [11]KRAUSE K M,OETZEL G R.Understanding and preventing subacute ruminal acidosis in dairy herds:a review[J].Animal Feed Science and Technology,2006,126:215-236.

        [12]KHAFIPOUR E,KRAUSE D O,PLAIZIER J C.A grain-based subacute ruminal acidosis challenge causes translocation of lipopolysaccharide and triggers inflammation[J].Journal of Dairy Science,2009,92(3):1060-1070.

        [13]KHAFIPOUR E,KRAUSE D O,PLAIZIER J C.Alfalfa pellet-induced subacute ruminal acidosis in dairy cows increases bacterial endotoxin in the rumen without causing inflammation[J].Journal of Dairy Science,2009,92(4):1712-1724.

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