王東升 霍文婕 朱偉云 毛勝勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095)

生物胺(biogenic amine，BA)是脂肪族、芳香族或雜環(huán)族的低分子質(zhì)量有機(jī)堿，常存在于動(dòng)植體內(nèi)及食品中［1］。反芻動(dòng)物瘤胃液中的生物胺主要是由瘤胃液中相關(guān)微生物產(chǎn)生的酶或飼料原料中固有的酶催化瘤胃液中游離氨基酸脫羧基生成［2］。正常狀態(tài)下，瘤胃液中生物胺濃度很低，但當(dāng)動(dòng)物攝入的蛋白質(zhì)或可發(fā)酵碳水化合物大量增加時(shí)，瘤胃液中的生物胺濃度會(huì)增加，進(jìn)而致宿主出現(xiàn)一系列疾病，如蹄葉炎等［3］。因此，建立瘤胃液中生物胺的檢測(cè)方法，對(duì)于了解瘤胃內(nèi)生物胺的生成規(guī)律具有重要意義。

盡管目前已有多種方法應(yīng)用于食品生物胺的測(cè)定，如:薄層色譜(TLC)、毛細(xì)管電泳(cE)、氣相色譜(GC)以及基于生物傳感器的方法等［1，4］，但有關(guān)瘤胃液中生物胺的檢測(cè)方法的報(bào)道很少，并且多為僅針對(duì)于某一類生物胺，如組胺或色胺等。實(shí)際上，瘤胃液中還可能存在腐胺、尸胺等源于氨基酸的異常代謝產(chǎn)物，而這些物質(zhì)也會(huì)對(duì)宿主健康帶來(lái)危害［3］。由此，為進(jìn)一步了解瘤胃內(nèi)生物胺的生成規(guī)律，本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法，建立瘤胃液生物胺的測(cè)定方法，擬為深入探討瘤胃內(nèi)氨基酸的代謝及生物胺的生成規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和樣品

色胺(tryptamine，TRY)、腐 胺(putrescine，PUT)、甲胺(methylamine，MET)、組胺(histamine，HIS)、酪胺(tyramine，TYR)、丹磺酰氯(dansyl chloride)均購(gòu)自Sigma公司。乙腈、乙酸銨和丙酮為色譜純;鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、冰乙酸為分析純;超純水(Milli-Q，Millipore公司)在實(shí)驗(yàn)室制備。瘤胃液采自飼喂精粗比為1∶9和7∶3的6頭長(zhǎng)江三角洲白山羊(雄性)，飼糧精飼料由70%玉米和30%豆粕組成，粗飼料由70%苜蓿和30%羊草組成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取色胺 16.0 mg、腐胺 16.1 mg、組胺11.1 mg、酪 胺 13.7 mg、甲胺 6.75 mg，用0.5 mol/L的鹽酸定容至10 mL，制成10 mol/L儲(chǔ)備液備用。分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用0.5 mol/L鹽酸配制成終濃度分別為10、100、1 000 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用鋁箔紙避光、-25℃保存。

1.2.2 樣品處理

取 100 μL 待測(cè)樣品加入150 μL 的0.5 mol/L的鹽酸，渦旋混勻后4℃下13 000 r/min離心10 min，沉淀部分如上述方法再提取1次。取2次的上清液用0.5 mol/L的鹽酸定容到10 mL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的衍生化

分別取上述的生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液200 μL，加入 100 μL 的飽和碳酸氫鈉溶液(用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=11)進(jìn)行緩沖，再加入100 μL的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(10 g/L，丙酮為溶劑)，然后置于60℃水浴中、黑暗條件下反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL的1%冰乙酸。衍生處理后，4℃下13 000 r/min離心10 min后取上清液待測(cè)［5］。

1.2.4 儀器設(shè)備

島津液相色譜系統(tǒng)(LC-10ATVP)。

1.2.5 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流速為1 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為 260 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為乙酸銨溶液，采用梯度洗脫，程序見(jiàn)表1。

1.2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取新鮮樣品，按照1.2.2方法處理樣品，取200 μL樣品加入5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，使之相當(dāng)于各添加125和250 μmol/L的濃度，3次重復(fù)試驗(yàn)，扣除樣品中空白試驗(yàn)生物胺的濃度，求得其回收率。

1.2.7 不同精粗比飼糧對(duì)山羊瘤胃液中生物胺濃度的影響

受試動(dòng)物為6頭裝有永久性瘤胃瘺管、體況良好的雄性長(zhǎng)江三角洲白山羊，單欄飼喂，自由飲水。受試動(dòng)物隨機(jī)分為2組，分別飼喂精粗比為1∶9(日飼喂精飼料 100 g，粗飼料900 g)和 7∶3(日飼喂精飼料700 g，粗飼料300 g)的飼糧。精飼料和粗飼料組成與1.1中相同。于08:00和20:00分2次等量飼喂。

適應(yīng)飼糧 18 d后，于第 19、20、21天飼喂(08:00)前采集瘤胃液，用于初步研究2種飼糧精粗比條件下飼喂前瘤胃液中5種生物胺的差異。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedures

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平置于 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 保留時(shí)間

本試驗(yàn)采用乙腈和水為流動(dòng)相，并采用表1所示的梯度程序洗脫。在使用單標(biāo)確定保留時(shí)間(表2)的基礎(chǔ)上，將5種單標(biāo)混合，取混合的混標(biāo)進(jìn)行色譜分離，由圖1、圖2可見(jiàn)，5種胺在40 min內(nèi)能得到很好分離，且峰形對(duì)稱，沒(méi)有拖尾等現(xiàn)象。

表2 5種生物胺的保留時(shí)間Table 2 Retention time of the five biogenic amines

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

將標(biāo)準(zhǔn)溶液依次以10、100和1 000 μmol/L進(jìn)樣，所得峰面積對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。本方法的檢出限是以信噪比(S/N)大于3作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，色胺的檢測(cè)限為10.0 μmol/L，甲胺的檢測(cè)限為 1.2 μmol/L，其余3 種胺的檢測(cè)限都為 1.0 μmol/L。

圖1 生物胺混標(biāo)色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of biogenic amine

圖2 瘤胃液生物胺色譜圖Fig.2 Chromatogram of biogenic amine in rumen liquid

2.3 回收率測(cè)定

由表4可知，5種生物胺的平均回收率如下:酪胺 94.97%、腐胺 95.54%、組胺 93.48%、甲胺92.90%、色胺 93.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10%，可見(jiàn)該方法可滿足檢測(cè)的需要。

2.4 飼糧精粗比對(duì)瘤胃液5種生物胺的影響

由表5可見(jiàn)，在2種飼糧精粗比條件下，高精料瘤胃液中酪胺與甲胺濃度均顯著高于低精料組(P＜0.05)，但二者間在腐胺、組胺及色胺濃度上無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表3 生物胺的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限Table 3 Regression equation，correlation coefficient square and the detectability of biogenic amine

表4 本試驗(yàn)方法的回收率Table 4 Average recovery of the method in the present study

表5 飼糧精粗比對(duì)瘤胃液中5種生物胺濃度的影響Table 5 Effects of dietary forage-to-concentrate ratio on concentrations of the five biogenic amines in rumen liquid μmol/L

3 討論

生物胺是一類含氮低分子化合物，對(duì)動(dòng)植物和微生物有重要的生理作用。適量的生物胺有助于動(dòng)物機(jī)體正常的生理功能，過(guò)量則會(huì)引起不良生理反應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)瘤胃內(nèi)生物胺的檢測(cè)主要采用液相色譜法，一般僅針對(duì)組胺［6］。實(shí)際上瘤胃中還含有其他的生物胺(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、尸胺、甲胺等)，且其存在會(huì)對(duì)組胺的毒性有協(xié)同作用［3，8-9］。因此，多組分生物胺的同時(shí)檢測(cè)對(duì)于了解瘤胃微生物對(duì)氨基酸的代謝以及研究瘤胃健康具有重要生物學(xué)意義。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用丹磺酰氯柱前衍生方法，應(yīng)用紫外檢測(cè)器能夠滿足分析檢測(cè)瘤胃液中生物胺的需求，瘤胃液中色胺、腐胺、甲胺、組胺、酪胺5種生物胺能在40 min內(nèi)得到很好分離。除了酪胺外，其他生物胺的線性范圍為10～1 000 μmol/L(R2＞0.99)，該方法的平均回收率分別為色胺 93.00%、腐 胺 95.54%、甲 胺92.90%、組胺 93.48%、酪胺 94.47%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。結(jié)果說(shuō)明采用該方法可用于分析瘤胃液中的生物胺，同時(shí)分離效果好，完全滿足瘤胃液中生物胺的檢測(cè)需要。

由于我國(guó)粗飼料資源相對(duì)有限，而生產(chǎn)者過(guò)度追求經(jīng)濟(jì)效益，在奶牛生產(chǎn)中使用了大量的精飼料，雖其結(jié)果會(huì)提高奶牛的產(chǎn)奶性能，但奶牛的消化代謝疾病明顯增多，使用壽命大大縮短，給畜牧生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失［10］。相關(guān)報(bào)道表明，奶牛飼糧中精飼料比例過(guò)高時(shí)，奶牛瘤胃內(nèi)常發(fā)生急性酸中毒，瘤胃內(nèi)乳酸累積，進(jìn)而引起酸中毒而死亡，而在慢性酸中毒情況下，瘤胃內(nèi)異常代謝產(chǎn)物如組胺和內(nèi)毒素等均會(huì)大量增加，使奶牛繼發(fā)其他疾?。?1-13］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高精料飼糧條件下，山羊瘤胃液中酪胺和甲胺濃度遠(yuǎn)高于低精料飼糧，提示飼糧精粗比對(duì)瘤胃內(nèi)生物胺的濃度具有較明顯的影響。但本試驗(yàn)中，筆者未發(fā)現(xiàn)飼糧精粗比對(duì)瘤胃液中組胺、色胺和腐胺濃度的影響，可能與采樣的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)系，本試驗(yàn)僅初步研究了飼喂前瘤胃液中5種生物胺的差異，而飼喂后瘤胃內(nèi)5種生物胺是如何變化的?飼糧精粗比對(duì)這5種生物胺濃度有何影響?目前尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)建立了反相高效液相色譜法測(cè)定瘤胃液中的5種生物胺的方法。

②飼糧精粗比可影響瘤胃液中生物胺濃度，高精料飼糧條件下瘤胃液中酪胺和甲胺濃度顯著增加。

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