林仕梅毛述宏關(guān) 勇潘 瑜羅 琳羅 莉

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716;2.淡水魚(yú)類(lèi)資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716;3.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068)

如何降低飼料成本是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和飼料生產(chǎn)者一直研究和關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。動(dòng)物性蛋白質(zhì)源因存在資源短缺等問(wèn)題，在飼料中的使用受到限制;而植物性蛋白質(zhì)源因存在抗?fàn)I養(yǎng)因子、適口性不佳和氨基酸不平衡等問(wèn)題，在飼料中的使用也受到限制。眾所周知，棉籽粕中存在棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能可產(chǎn)生不利的影響，但其合理的利用是安全可行的［1-3］。目前，已在部分養(yǎng)殖魚(yú)品種［3-7］上開(kāi)展了棉籽粕使用效果的評(píng)估，因原料質(zhì)量、試驗(yàn)魚(yú)種類(lèi)和配方結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致研究結(jié)果不盡一致，雖有效果較好者，但棉籽粕的用量仍然有一定限制。此外，有一些研究通過(guò)對(duì)棉籽粕采用脫酚［8-10］或酶解［11］等工藝來(lái)改善其品質(zhì)，并取得了較好的使用效果。我國(guó)棉籽年產(chǎn)量在1.0×107t以上，棉籽粕年產(chǎn)量在6.0×106t以上，脫酚棉籽蛋白(粗蛋白質(zhì)含量≥50%)年產(chǎn)量在3.2×105t左右，并于2008年1月1日正式頒布實(shí)施了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) GH/T 1042—2007《脫酚棉籽蛋白》。如何在飼料中最大限度地用好脫酚棉籽蛋白，同時(shí)又不影響?zhàn)B殖動(dòng)物的生長(zhǎng)和健康，這值得深入研究。

鑒于此，本試驗(yàn)以羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)為試驗(yàn)對(duì)象，在等氮等能實(shí)用飼料的基礎(chǔ)上，從生長(zhǎng)性能、體組成、消化酶活性、肝功能和非特異性免疫功能等方面比較和評(píng)價(jià)脫酚棉籽蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以期為脫酚棉籽蛋白在水產(chǎn)飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

脫酚棉籽蛋白是以棉籽為原料，采用液-液-固脫酚工藝(專(zhuān)利號(hào):ZL 00 1 345620.6)生產(chǎn)，由北京中棉紫光生物科技有限公司提供。

參照NRC(1993)魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合我國(guó)的生產(chǎn)實(shí)際，配制羅非魚(yú)實(shí)用飼料(含魚(yú)粉6.0%，魚(yú)粉粗蛋白質(zhì)含量為64.5%)。在實(shí)用飼料的基礎(chǔ)上用脫酚棉籽蛋白分別替代0、50%和100%的魚(yú)粉，配制成3種等氮等能的試驗(yàn)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料均粉碎過(guò)40目篩，飼料調(diào)質(zhì)溫度為80℃，制成粒徑為2.5 mm的硬顆粒飼料，60℃烘干后于-15℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚(yú)選用當(dāng)年培育的雄性吉富羅非魚(yú)(平均體重為50 g)270尾，隨機(jī)分成3組(每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾)，其中飼喂替代水平為0的試驗(yàn)飼料的組為對(duì)照組。試驗(yàn)魚(yú)飼養(yǎng)在室內(nèi)淡水循環(huán)玻璃水族箱(有效體積為300 L)中，水源為曝氣自來(lái)水，水溫為(27.8±2.2)℃，pH 為7.4±0.4，溶解氧 ＞6.5 mg/L，氨氮 ＜0.50 mg/L，亞硝酸鹽氮＜0.06 mg/L。日投喂率為體重的2% ～4%，每天08:30、12:30和17:30各投喂1次，飼養(yǎng)時(shí)間為8周。

1.3 樣品制備與分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h后稱(chēng)重，每重復(fù)隨機(jī)取3尾魚(yú)作為全魚(yú)樣品，用于體組成的測(cè)定;每重復(fù)另隨機(jī)取3尾魚(yú)，采用搗毀脊髓法處死，分離出肝胰臟，并立即放入液氮罐中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃保存?zhèn)溆?。按肝胰臟質(zhì)量加入10倍體積的 pH 7.4、0.2 mol/L 的磷酸緩沖液，用玻璃勻漿器勻漿后在10 000×g、4℃條件下離心30 min，取上清液作為酶活性分析樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

飼料原料及全魚(yú)樣品均在105℃烘干至恒重，然后采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量，索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量，高溫(550℃)灼燒法測(cè)定灰分含量。

肝胰臟胰蛋白酶、淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。胰蛋白酶活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)在37℃時(shí)與底物作用15 min，分解酪蛋白生成1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活性單位。淀粉酶活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)在37℃時(shí)與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為1個(gè)酶活性單位。

肝胰臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，總抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)和肝糖原含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。GOT、GPT活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)與基質(zhì)在37℃下作用60 min，生成1 μmol丙酮酸所需要的酶量為1個(gè)酶活性單位;SOD活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所反應(yīng)的SOD量為1個(gè)酶活性單位。T-AOC單位定義為在37℃時(shí)，每分鐘每毫克組織蛋白質(zhì)使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時(shí)為1個(gè)T-AOC單位。組織中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.4 計(jì)算公式

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=100×［ln末重(g)-

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

除成活率外，數(shù)據(jù)均以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 11.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異達(dá)到顯著水平，則進(jìn)行Duncan氏多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，50%替代水平組羅非魚(yú)的末重顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而與100%替代水平組差異不顯著(P＞0.05)。羅非魚(yú)的特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率、飼料效率和攝食率組間差異不顯著(P＞0.05)，其中特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率和飼料效率均以50%替代水平組最高。各組羅非魚(yú)的成活率均為100%。

2.2 低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)體組成的影響

由表3可知，隨著脫酚棉籽蛋白替代水平的增加，羅非魚(yú)的內(nèi)臟指數(shù)顯著增加(P＜0.05)。各組羅非魚(yú)的肝胰指數(shù)和肥滿(mǎn)度無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但隨著脫酚棉籽蛋白替代水平的增加，肝胰指數(shù)呈增加趨勢(shì)，而肥滿(mǎn)度則呈降低趨勢(shì)。脫酚棉籽蛋白替代不同水平魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)的全魚(yú)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量均無(wú)顯著影響(P ＞0.05)。

表2 低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of replacement of fish meal with degossypolled cottonseed protein in low fish meal diets on growth performance of tilapia

表3 低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)體組成的影響(濕重基礎(chǔ))Table 3 Effects of replacement of fish meal with degossypolled cottonseed protein in low fish meal diets on body composition of tilapia(wet weight basis) %

2.3 低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)肝胰臟消化酶活性的影響

由表4可知，脫酚棉籽蛋白替代不同水平魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)的肝胰臟胰蛋白酶和淀粉酶活性有顯著影響(P＜0.05)。50%替代水平組羅非魚(yú)的肝胰臟胰蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組和100%替代水平組(P＜0.05)，但對(duì)照組與100%替代水平組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。隨著脫酚棉籽蛋白替代水平的增加，肝胰臟淀粉酶活性顯著增加(P ＜0.05)。

表4 低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)肝胰臟消化酶活性的影響Table 4 Effects of replacement of fish meal with degossypolled cottonseed protein inlow fish meal diets on digestive enzyme activities in hepatopancreas of tilapia U/mg prot

2.4 低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)肝胰臟代謝、抗氧化指標(biāo)以及肝糖原含量的影響

由表5可知，脫酚棉籽蛋白替代不同水平魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)的肝胰臟代謝、抗氧化指標(biāo)以及肝糖原含量均有顯著影響(P＜0.05)。隨著脫酚棉籽蛋白替代水平的增加，羅非魚(yú)的肝胰臟T-AOC，GPT、GOT、SOD活性和肝糖原含量均顯著降低(P＜0.05);而MDA含量則表現(xiàn)出與上述指標(biāo)相反的變化規(guī)律，即隨著脫酚棉籽蛋白替代水平的增加而顯著增加(P＜0.05)。

表5 低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉對(duì)羅非魚(yú)肝胰臟代謝、抗氧化指標(biāo)以及肝糖原含量的影響Table 5 Effects of replacement of fish meal with degossypolled cottonseed protein in low fish meal diets on metabolism and antioxidant indices and liver glycogen content in hepatopancreas of tilapia

3 討論

從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在低魚(yú)粉飼料(魚(yú)粉用量為6.0%)中脫酚棉籽蛋白完全替代魚(yú)粉不會(huì)影響羅非魚(yú)的生長(zhǎng)效果和飼料利用率。棉籽粕因含有游離棉酚且賴(lài)氨酸含量低而影響其在羅非魚(yú)飼料中的用量［7］。研究表明，網(wǎng)箱中養(yǎng)殖的雜交羅非魚(yú)的飼料中可用棉籽粕替代50%的豆粕［12］，如果飼料中再補(bǔ)充賴(lài)氨酸，棉籽粕還可以替代60%的豆粕，最終棉籽粕用量達(dá)到33.76%［13］;而在尼羅羅非魚(yú)飼料中補(bǔ)充鐵(鐵∶游離棉酚=1∶1)，棉籽粕則可以完全替代魚(yú)粉［14］。上述結(jié)果表明，羅非魚(yú)對(duì)棉籽粕的耐受能力因其品種或飼料配方差異而不同。目前，主要通過(guò)改善加工工藝、補(bǔ)充必需氨基酸、降低或消除抗?fàn)I養(yǎng)因子等手段來(lái)提高植物蛋白質(zhì)源在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的使用量。羅琳等［8］研究表明，日本鱸飼料(魚(yú)粉用量為45%)中脫酚棉籽蛋白的替代水平以不超過(guò)50%的魚(yú)粉蛋白質(zhì)為宜。Luo等［9］研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒幼魚(yú)的飼料(魚(yú)粉用量為22.5%)中可以用30.5%脫酚棉籽蛋白替代50.0%的秘魯魚(yú)粉而不影響其生產(chǎn)性能。吳秀峰等［10］研究認(rèn)為，西伯利亞鱘幼魚(yú)飼料(魚(yú)粉用量為48%)中脫酚棉籽粉可替代40%的魚(yú)粉蛋白質(zhì)。Gui等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在異育銀鯽飼料(棉籽粕用量為13%)中添加5%的棉籽粕酶解物是比較適宜的。上述研究結(jié)果表明，不同來(lái)源的棉籽蛋白在水產(chǎn)飼料中的合理利用均是可行的，但不同的魚(yú)種對(duì)不同來(lái)源的棉籽蛋白的耐受劑量是不同的。

用植物蛋白質(zhì)源替代魚(yú)粉往往因飼料適口性差導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物攝食率降低，進(jìn)而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)［15］。Luo 等［9］研究指出，飼料中添加脫酚棉籽蛋白使虹鱒幼魚(yú)生長(zhǎng)性能降低，并認(rèn)為這主要是因飼料適口性變差，導(dǎo)致攝食率下降所致。本研究中，脫酚棉籽蛋白替代不同水平魚(yú)粉并沒(méi)有影響羅非魚(yú)的攝食率，表明脫酚棉籽蛋白對(duì)羅非魚(yú)飼料適口性的影響在其可接受范圍內(nèi)。當(dāng)飼料中游離棉酚超過(guò)一定量時(shí)，會(huì)使單胃動(dòng)物中毒，包括魚(yú)類(lèi)［4］。Robinson 等［16］研究指出，奧利亞羅非魚(yú)對(duì)游離棉酚的耐受劑量為180 mg/kg。然而，本研究中各試驗(yàn)飼料中游離棉酚含量均低于170 mg/kg，但脫酚棉籽蛋白的添加對(duì)吉富羅非魚(yú)的生理功能產(chǎn)生了一定程度的負(fù)面影響。上述結(jié)果表明，不同魚(yú)種對(duì)游離棉酚的耐受能力是不同的。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉水平會(huì)顯著影響羅非魚(yú)的消化酶活性，替代水平為50%的組羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能最好，其肝胰臟胰蛋白酶活性最高，這提示羅非魚(yú)生長(zhǎng)效果的改善主要是因其消化能力的提高。不同植物蛋白質(zhì)源因抗?fàn)I養(yǎng)因子種類(lèi)、含量不同而對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)消化酶活性產(chǎn)生不同的影響［17-18］。本研究中，當(dāng)脫酚棉籽蛋白替代50%的魚(yú)粉時(shí)，飼料中游離棉酚含量有所增加，但羅非魚(yú)的肝胰臟胰蛋白酶活性不降反增，這可能是魚(yú)類(lèi)消化酶活性對(duì)飼料組成變化的適應(yīng)性調(diào)整。

本試驗(yàn)中，隨著脫酚棉籽蛋白替代水平的增加，羅非魚(yú)的肝胰臟GOT和GPT活性降低，而生長(zhǎng)性能并未受到影響。這表明羅非魚(yú)的肝功能受到了一定程度的損傷，但還未危及到羅非魚(yú)的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)飼養(yǎng)周期為8周，而飼養(yǎng)周期對(duì)試驗(yàn)結(jié)果是否有影響，這是值得深入研究的。Blom等［19］研究指出，用棉籽粕完全替代飼料中魚(yú)粉飼養(yǎng)虹鱒6個(gè)月，不影響虹鱒的生長(zhǎng)性能和成活率，但會(huì)降低雌性親本的繁殖性能。Lee等［6］用棉籽粕替代飼料中魚(yú)粉飼養(yǎng)虹鱒親魚(yú)3年(體重由250 g增加到4 000 g)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虹鱒飼料中棉籽粕可以完全替代魚(yú)粉而不會(huì)影響虹鱒的生長(zhǎng)和繁殖性能;然而，在飼養(yǎng)周期的第1年和第2年，飼料中棉籽粕的增加卻顯著降低了虹鱒的血細(xì)胞比容、血紅蛋白含量。有關(guān)虹鱒的研究還表明，用菜籽濃縮蛋白替代75%的魚(yú)粉飼養(yǎng)虹鱒63 d，虹鱒的生長(zhǎng)性能未受到影響［20］;但用菜籽濃縮蛋白替代50%的魚(yú)粉飼養(yǎng)虹鱒140 d，虹鱒的生長(zhǎng)性能顯著降低［21］。上述研究結(jié)果說(shuō)明，飼養(yǎng)周期會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，對(duì)魚(yú)類(lèi)利用植物蛋白質(zhì)源的評(píng)價(jià)應(yīng)該對(duì)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行整個(gè)生長(zhǎng)周期的研究，這樣得出的結(jié)果才是最科學(xué)、最準(zhǔn)確的。

研究指出，飼料組成會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的非特異性免疫功能產(chǎn)生影響［22-23］。作者前期相關(guān)的研究也發(fā)現(xiàn)，不同植物蛋白質(zhì)源對(duì)羅非魚(yú)的非特異性免疫功能可產(chǎn)生不同的影響，以菜籽粕、棉籽粕對(duì)羅非魚(yú)肝胰臟GOT、GPT和SOD活性的影響最大，其次是花生粕，而以豆粕的影響最小［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著脫酚棉籽蛋白替代水平的增加，羅非魚(yú)肝胰臟的抗氧化能力顯著降低，表明飼料中脫酚棉籽蛋白已對(duì)羅非魚(yú)的免疫和防御系統(tǒng)產(chǎn)生了負(fù)面影響。作者前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，飼料配方中菜籽粕、棉籽粕總量超過(guò)52%會(huì)顯著影響羅非魚(yú)血清 GOT、GPT、SOD 和 溶 菌 酶 活 性［3］。Burrells等［25］研究發(fā)現(xiàn)，隨著大豆蛋白替代魚(yú)粉水平的增加，虹鱒的吞噬指數(shù)和呼吸爆發(fā)活性顯著下降。Krogdahl等［26］研究發(fā)現(xiàn)，大豆品種的不同會(huì)顯著影響大西洋鮭的溶菌酶活性和抗體水平。這些研究表明，飼料中不同植物蛋白質(zhì)源及其添加水平均能夠影響?hù)~(yú)類(lèi)的免疫系統(tǒng)，從而使其免疫應(yīng)答反應(yīng)出現(xiàn)差異。

4 結(jié)論

①在低魚(yú)粉飼料中，脫酚棉籽蛋白可以完全替代魚(yú)粉而不影響羅非魚(yú)的生長(zhǎng)性能，但對(duì)其免疫應(yīng)答會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。

②綜合分析可知，羅非魚(yú)低魚(yú)粉飼料中脫酚棉籽蛋白替代魚(yú)粉的水平以不超過(guò)50%為宜。

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