李雪吟馮 琳，2，3劉 揚(yáng)，2姜 俊，2周小秋，2，3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與安全生產(chǎn)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

1989年，Lee等［1］在觀察海膽受精過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，精卵結(jié)合導(dǎo)致輔酶Ⅰ(NAD+)分解產(chǎn)生的環(huán)腺苷二磷酸核糖(cADPR)可激活相關(guān)鈣庫(kù)的離子通道。cADPR是多種細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)Ca2+濃度的第二信使［2－3］。一系列的生理刺激都會(huì)引起胞內(nèi)cADPR濃度的改變，cADPR通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(肌漿網(wǎng))上蘭尼堿受體(RyR)通道，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(肌漿網(wǎng))內(nèi)儲(chǔ)存的 Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)［3－4］。cADPR可以在神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)Ca2+濃度，從而刺激神經(jīng)細(xì)胞增殖分化［5］、介導(dǎo)肌細(xì)胞收縮［2，4］和激活 T 淋巴細(xì)胞［3］。本文主要對(duì)cADPR的合成方式及其在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)Ca2+釋放的作用機(jī)制做一綜述。

1 cADPR的化學(xué)結(jié)構(gòu)

cADPR是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸分解產(chǎn)生，腺苷酸的N1位與核糖 C1″、腺苷酸N9位與核糖C1'分別以β構(gòu)象相連，形成環(huán)化結(jié)構(gòu)，同時(shí)腺苷酸上N6與C6位單鍵變?yōu)殡p鍵，從而增強(qiáng)了其活性。cADPR是由NAD+水解后的長(zhǎng)鏈分子形成的頭尾相連的環(huán)化結(jié)構(gòu)，因此它在室溫下比較穩(wěn)定［6］。核糖的主要作用是通過(guò)其上的氧原子連接腺嘌呤與磷酸。研究表明，當(dāng)用甲基取代C1″位氧原子后，cADPR失去活性，但即使用醚鍵取代核糖，cADPR 仍能引起 Ca2+的釋放［7］。

2 cADPR的合成途徑

在哺乳動(dòng)物上，cADPR的合成是以β-NAD+為底物，由 CD38 酶催化產(chǎn)生［2，4］。CD38 是一種跨膜糖蛋白，活性中心位于胞外，6個(gè)不變氨基酸殘基在活性中心形成口袋狀結(jié)構(gòu)，使NAD+和輔酶Ⅱ(NADP)能夠和活性部位嵌合，使長(zhǎng)鏈分子折疊，首尾相連形成環(huán)化結(jié)構(gòu)，10個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基使二硫鍵位置固定，從而維持其高級(jí)結(jié)構(gòu)［8］。CD38在脊椎動(dòng)物造血組織、肌肉組織及內(nèi)分泌組織中廣泛的表達(dá)并具有多種酶的活性［9］。cADPR的生成需要NAD+與胞外的CD38活性中心反應(yīng)，但NAD+主要存在于細(xì)胞內(nèi)和血漿中，細(xì)胞外的濃度僅在 10 ～40 nmol/L［10］。NAD+可由連接蛋白43(Cx43)介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)出胞。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制小鼠3T3成纖維細(xì)胞膜上Cx43基因的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)外NAD+的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)被完全抑制［11］，同時(shí)胞內(nèi)cADPR的含量也顯著降低［12］。將純化的Cx43基因構(gòu)建于蛋白脂質(zhì)體膜上，NAD+的轉(zhuǎn)運(yùn)活性得到了恢復(fù)［11］。Cx43是排列于各細(xì)胞間的六聚體通道蛋白，形成了細(xì)胞間的縫隙連接，可以通過(guò)它們進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的物質(zhì)交換［11］。NAD+的轉(zhuǎn)運(yùn)受到多種因素的調(diào)控。螯合NIH-3T3細(xì)胞內(nèi)外Ca2+后，細(xì)胞內(nèi)外NAD+的流量顯著增高，而增加胞內(nèi)Ca2+濃度后，NAD+的轉(zhuǎn)運(yùn)降至最低［11－12］。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度的升高可激活蛋白激酶C引起Cx43磷酸化，磷酸化后的Cx43失去轉(zhuǎn)運(yùn)功能［12］。另外，小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)NAD+的轉(zhuǎn)運(yùn)還與細(xì)胞膜上CD38的表達(dá)量呈反比關(guān)系［12］。cADPR作用的靶位點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存膜上的RyR［13］，因此細(xì)胞外合成的cADPR必須被運(yùn)送至胞內(nèi)才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。cADPR的轉(zhuǎn)運(yùn)需要 CD38 的參與［11－12］，但 CD38 只能轉(zhuǎn)運(yùn)自身催化合成的cADPR，外源添加的cADPR不能被CD38轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)［14］。CD38可能在催化過(guò)程中發(fā)生了構(gòu)象改變，從而具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性。CD38還可能在翻譯后發(fā)生交聯(lián)，從而形成多聚體，使其可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能［15］。Franco 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，蛋白脂質(zhì)體膜上表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量為46、86～112、197的3種類(lèi)型的CD38，CD38可能以多聚體的形式形成了cADPR通道，使cADPR迅速內(nèi)流。

生物體除了通過(guò)將底物轉(zhuǎn)運(yùn)出胞再將產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)入胞這種相對(duì)復(fù)雜的方式合成cADPR外，它還可以通過(guò)配體介導(dǎo)CD38內(nèi)化，使催化反應(yīng)直接在胞內(nèi)進(jìn)行［9，16］。將人類(lèi) CD38基因轉(zhuǎn)染到 Hela細(xì)胞，配體NAD+介導(dǎo)CD38以囊泡的形式逐漸內(nèi)化［17］。白介素－8(IL-8)可誘導(dǎo)人類(lèi)淋巴細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞表面的CD38內(nèi)化［16］。CD38的內(nèi)化與高度保守的半胱氨酸殘基密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸－119和半胱氨酸－201位突變后的CD38分子不能內(nèi)化，119位和201位半胱氨酸殘基通過(guò)形成分子間二硫鍵，使CD38以二聚體形式內(nèi)化［18］。內(nèi)化的CD38仍具有酶的活性，能催化產(chǎn)生cADPR、調(diào)節(jié)Ca2+濃度［16］。在多種類(lèi)型的細(xì)胞內(nèi)，配體NAD+在引起細(xì)胞膜表面環(huán)化酶活性降低的同時(shí)，胞內(nèi)Ca2+的濃度也升高，但如果CD38 缺失，這種作用則完全消失［9，16］。

3 cADPR介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+釋放途徑

cADPR的主要功能是釋放胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+。在海膽卵細(xì)胞［1］、小鼠成纖維細(xì)胞［12］、小鼠生精小管外周平滑肌細(xì)胞［2］及人 T 淋巴細(xì)胞［3］，cADPR都可引起胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+的釋放。cADPR釋放Ca2+的途徑是通過(guò)激活Ca2+儲(chǔ)存膜上對(duì)蘭尼堿敏感的 RyR［19－20］。但也有不一致的報(bào)道，cADPR 可以引起牛冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)膜RyR通道的開(kāi)放，而抑制RyR通道活性后，cADPR不能引起Ca2+的釋放［13］;在豬心肌RyR脂雙分子層上，cADPR不能介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+的釋放［21］。RyR是由相對(duì)分子質(zhì)量為560的多肽組成的同源四聚體對(duì)稱(chēng)型離子通道，它是一種跨膜蛋白，90%的氨基酸序列位于胞漿內(nèi)，其上有多種調(diào)節(jié)蛋白的連接位點(diǎn)，他克莫司連接蛋白(FKBP)可與每個(gè)亞基上特異位點(diǎn)結(jié)合，并在一定程度上引起RyR的構(gòu)象改變，從而調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能［22］。FKBP在牛冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞［19］、氣管平滑肌細(xì)胞［20］、小鼠膀胱平滑肌細(xì)胞［23］內(nèi)廣泛地表達(dá)。特異表達(dá)的FKBP與肌漿網(wǎng) RyR 結(jié)合［19－20］。FKBP 可以穩(wěn)定RyR的關(guān)閉狀態(tài)，從而抑制RyR的活性。將FKBP透析入氣管平滑肌細(xì)胞，Ca2+通道的開(kāi)放率顯著降低，若使 FKBP與 RyR分離，Ca2+的釋放增加［20］。FKBP還會(huì)減少由刺激引起的RyR通道的開(kāi)放，由去極化誘導(dǎo)FKBP基因敲除的小鼠膀胱平滑肌細(xì)胞Ca2+的局部釋放高于野生型小鼠［23］。cADPR激活RyR通道是通過(guò)與FKBP特異位點(diǎn)結(jié)合使FKBP與RyR分離。研究發(fā)現(xiàn)，cADPR可以引起牛冠狀動(dòng)脈平滑肌肌漿網(wǎng)膜Ca2+通道的開(kāi)放，而 FKBP表達(dá)被抑制后，cADPR不能引起Ca2+的釋放;將 cADPR透析入平滑肌細(xì)胞后，Ca2+的釋放量顯著增加，并且此時(shí)形成了cADPRFKBP復(fù)合物，使 FKBP與 RyR分離，Ca2+通道開(kāi)放［19－20］。

cADPR激活RyR還需要鈣調(diào)蛋白的參與。鈣調(diào)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為16.7，對(duì)Ca2+的親和力很高，它能與RyR各亞基特異位點(diǎn)結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能［22，24］。無(wú)鈣調(diào)蛋白的海膽卵微粒體和鼠胰島微粒體失去了對(duì)cADPR的敏感性，加入純化的鈣調(diào)蛋白后，其敏感性得以恢復(fù)，Ca2+釋放增加［24］。鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)RyR通道活性的方式是通過(guò)與RyR復(fù)合物特異結(jié)合和分離這種循環(huán)過(guò)程來(lái)完成的［24］。影響鈣調(diào)蛋白與RyR連接的主要因素是胞漿內(nèi)游離Ca2+的濃度。當(dāng)游離Ca2+的濃度改變時(shí)，兔心肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白與RyR的親和力發(fā)生變化，引起RyR構(gòu)象改變從而調(diào)節(jié)Ca2+通道的開(kāi)放［25］。綜上所述，cADPR激活RyR還需要鈣調(diào)蛋白的參與，而胞漿內(nèi)游離Ca2+的濃度又是影響鈣調(diào)蛋白與RyR結(jié)合的主要因素，二者相互作用從而保證細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的平衡。

4 cADPR的生理功能

研究發(fā)現(xiàn)，cADPR是多種細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)Ca2+濃度的第二信使。外源的刺激引起cADPR合成量增加，釋放胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+，Ca2+濃度的升高引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生一系列生理反應(yīng)［4］。在大鼠生精小管外周平滑肌細(xì)胞［2］、小鼠胰島細(xì)胞［17］、人 T淋巴細(xì)胞［3］、PC12 細(xì)胞［5］，滲透化處理的 cADPR都可使胞內(nèi)Ca2+濃度改變、引起肌細(xì)胞收縮、促進(jìn)胰島素分泌、活化T淋巴細(xì)胞和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖分化。外源的各種刺激主要是通過(guò)上調(diào)cADPR合成酶的分泌量，使cADPR合成增加。用內(nèi)皮縮血管肽－1(ET-1)刺激大鼠生精小管外周平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞膜上CD38酶的活性顯著增強(qiáng)，平滑肌細(xì)胞收縮增強(qiáng)［2］。在不同組織中，cADPR的效應(yīng)時(shí)間不同［5，17］，并且效應(yīng)強(qiáng)度也有差別。在新西蘭白鼠脈平滑肌細(xì)胞和PC12細(xì)胞內(nèi)，cADPR拮抗劑只能部分抑制外援刺激引起的生理反應(yīng)［4－5］。說(shuō)明在不同細(xì)胞內(nèi)由cADPR介導(dǎo)的Ca2+釋放程度不同，可能還存在其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過(guò)與cADPR途徑協(xié)調(diào)作用，使生物體對(duì)外源刺激的調(diào)控機(jī)制更加精密。

表1 cADPR在不同組織內(nèi)的第二信使功能Table 1 Roles of cADPR as a second messenger in various tissues

5 小結(jié)

cADPR是調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度的第二信使。通過(guò)傳遞細(xì)胞外的信號(hào)，釋放胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存，產(chǎn)生一系列相應(yīng)的生理反應(yīng)。cADPR的合成機(jī)制非常嚴(yán)密，不僅底物與酶由區(qū)室化的細(xì)胞器隔開(kāi)，而且生成的產(chǎn)物也必須由催化激活的轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)發(fā)揮功能。生物體還可直接將CD38內(nèi)化，從而使整個(gè)過(guò)程在胞內(nèi)進(jìn)行。生成的cADPR激活胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存膜上的RyR，這個(gè)過(guò)程可能需要FKBP和鈣調(diào)蛋白的參與，使胞內(nèi)Ca2+調(diào)控機(jī)制更加精密。目前的研究主要集中于cADPR功能的研究，對(duì)外源刺激引起cADPR合成的分子機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。目前對(duì)cADPR的靶位點(diǎn)RyR的分子結(jié)構(gòu)研究較少，而認(rèn)識(shí)RyR的分子結(jié)構(gòu)也是我們深入了解cADPR在體內(nèi)發(fā)揮作用的前提。

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