李 超，王乃馨，鄭 義，嚴茂飛，李姣姣

杜衡揮發(fā)油微波輔助提取及氣相色譜-質譜聯(lián)用分析

李 超，王乃馨，鄭 義，嚴茂飛，李姣姣

(徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008)

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken設計對杜衡揮發(fā)油微波提取工藝中的液料比、微波功率和微波時間3因素進行研究，分析各因素與得率的關系，得出優(yōu)化組合，并建立數(shù)學模型。結果表明：最佳的工藝條件為液料比(mL/g)8.3:1、微波功率309W、微波時間154s；在此條件下做驗證實驗，得出杜衡揮發(fā)油得率7.96%，與理論值7.90%基本一致，說明回歸模型能較好地預測杜衡揮發(fā)油提取得率。采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對杜衡揮發(fā)油成分進行分離鑒定，分離出25種成分，共確認了其中19種，采用峰面積歸一化法確定了各成分的相對含量。本方法可為杜衡的進一步開發(fā)和利用提供參考。

微波輔助提??；杜衡；揮發(fā)油；響應曲面法；氣相色譜-質譜聯(lián)用

杜衡(Asarum forbesii Maxim.)為馬兜鈴科細辛屬植物杜衡的根莖及草或全草，又名馬辛、南細辛、馬蹄香、馬蹄細辛，為多年生草本植物，產(chǎn)于江蘇、安徽、浙江、江西、河南南部、湖北及四川東部。本品全草入藥，具有驅風逐寒、消痰引水、活血平喘、定痛等作用[1]。杜衡主要有效成分為揮發(fā)油，其常用提取方法有水蒸氣蒸餾法、熱回流提取等，都存在提取時間長等缺點。微波輔助提取作為一種優(yōu)良的提取方法，具有操作簡便快捷、提取時間短及提出率高等特點，廣泛應用在生物活性物質的提取方面[2-9]。運用微波輔助提取杜衡揮發(fā)油的工藝及其成分分析未見報道，本實驗在單因素試驗基礎上運用響應曲面法研究微波輔助提取其揮發(fā)油的最佳工藝參數(shù)，同時通過氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對揮發(fā)油成分進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜衡 安徽亳州市三義堂藥業(yè)有限責任公司。石油醚(30～60℃)、乙醚、正己烷、乙酸乙酯和無水Na2SO4皆為分析純。

1.2 儀器與設備

標準檢驗篩 浙江上虞華美儀器紗篩廠；風選中藥粉碎機 山東省青州市精誠機械制造有限公司；FA2104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；SENCO R201L旋轉蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；XMT-152電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波提取

杜衡粉碎后過80目篩，精確稱取約5g置于100mL特制三角瓶中，加入一定體積的提取劑后，按照試驗設計提取一定時間后，在提取液加入無水Na2SO4后過濾，旋轉蒸發(fā)后稱量。根據(jù)CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀的特點，提取時將超聲波處于關閉狀態(tài)。

1.3.2 工藝優(yōu)化設計

1.3.2.1 單因素試驗

分別以提取劑種類、液料比、微波功率和微波時間為影響因素考察其對得率的影響。

1.3.2.2 Box-Behnken試驗設計

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，選取液料比、微波功率和微波時間3個影響因素，采用三因素三水平響應曲面分析方法，因素與水平設計見表1。共15個試驗點，其中12個為析因點，3個為中心點。

表1 杜衡揮發(fā)油微波輔助提取Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Coded variables and their coded levels in response surface analysis

設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為：

式中：EY為預測響應值；xi和xj為自變量代碼值；β0為常數(shù)項，βi為線性系數(shù)，βij為交互項系數(shù)，βii為二次項系數(shù)，ε為隨機誤差。按照Box-Behnken試驗設計的統(tǒng)計學要求，對方程的各項回歸系數(shù)進行回歸擬合。

1.3.3 得率的計算

1.4 氣相色譜-質譜聯(lián)用分析條件

氣相色譜條件：色譜柱：HP-5(30m×0.25mm，0.25μm)；進樣溫度260℃；升溫程序為初始溫度60℃保持1min，20℃/min升溫至100℃，10℃/min升溫至250℃，20℃/min升溫至290℃、保持5min。載氣He，流量為1.0mL/min，溶劑延遲時間：3min；分流比為50:1；進樣量為0.2μL。

質譜條件：EI離子源，離子源溫度230℃，電子能量70eV，質量掃描范圍33～500u，接口溫度280℃。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取劑種類的影響

為考察提取劑種類對杜衡揮發(fā)油得率的影響，試驗設定液料比6:1(mL/g)、微波功率200W和微波時間90s，在不同提取劑條件下對得率進行研究，結果見圖1。

圖1 提取劑種類對得率的影響Fig.1 Effect of different solvents on oil yield

作為提取杜衡揮發(fā)油的理想溶劑應具有以下特性：對揮發(fā)油的溶解性好、選擇性好，性質穩(wěn)定、價格低廉、來源廣泛。杜衡揮發(fā)油的提取屬于固-液萃取過程，提取效果主要由原料顆粒度和溶劑的性質決定。從圖1可知，4種溶劑中出得率最高的為正己烷7.19%，同時注意到采用正己烷和乙酸乙酯的得率相差不大，但乙酸乙酯的價格卻是正己烷的二分之一。因此選擇乙酸乙酯作為杜衡揮發(fā)油的提取劑。

2.1.2 液料比的影響

為考察液料比對杜衡揮發(fā)油得率的影響，選擇乙酸乙酯作為提取劑，同時設定微波功率200W和微波時間90s，在不同液料比條件下對得率進行研究，結果見圖2。

由圖2可知，乙酸乙酯的增加，更有利于杜衡揮發(fā)油的溶出，這是因為溶劑和原料間的濃度差越大，其提取效率就越高，目標物質就越容易溶出，然而在液料比增加到8:1之后，杜衡揮發(fā)油得率有下降的趨勢，這是因為當溶劑過大時，微波的能量對沉滯低層的杜衡顆粒的熱效應(相同時間提供的熱量被提取劑吸收的比例增加)的強度減弱，影響提取的效果，同時會造成溶劑和能源的浪費，并給后續(xù)的濃縮工作帶來困難。因此選擇液料比為8:1進入后續(xù)試驗。

圖2 料液比對得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on oil yield

2.1.3 微波功率的影響

為考察微波功率對杜衡揮發(fā)油得率的影響，試驗選擇乙酸乙酯作為提取劑，同時設定液料比8:1(mL/g)和微波時間90s，在不同微波功率的條件下對得率進行研究，結果見圖3。

圖3 微波功率對得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on oil yield

由圖3可知，隨著微波功率的增加，物質的加熱程度也隨之增加，使杜衡揮發(fā)油能夠容易地被提取出來，即得率增加；在微波功率達到300W之后，杜衡揮發(fā)油得率有減少的趨勢，這可能是由于高微波功率的熱效應導致杜衡揮發(fā)油分解或揮發(fā)所致[10]。因此選擇300W進入后續(xù)試驗。

2.1.4 微波時間的影響

為考察微波時間對杜衡揮發(fā)油得率的影響，試驗選擇乙酸乙酯作為提取劑，同時設定液料比8:1(mL/g)和微波功率300W，在不同微波功率的條件下對得率進行研究，結果見圖4。

由圖4可知，在微波時間為150s之前，杜衡揮發(fā)油不能充分轉移到溶液中，隨著微波時間的延長，杜衡揮發(fā)油得率增加，在150s時達到峰值，之后，繼續(xù)延長時間，得率有所下降，這可能是因為隨著微波時間的延長，溫度急劇升高，導致杜衡揮發(fā)油分解或揮發(fā)所致[11-12]。因此150s為最佳微波時間。

圖4 微波時間對得率的影響Fig.4 Effect of microwave treatment time on oil yield

2.2 Box-Behnken試驗

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

表2 微波輔助提取杜衡揮發(fā)油Box-Behnken試驗結果Table 2 Box-Behnken experimental design scheme and corresponding experimental results

表3 響應曲面二次回歸方程模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance of the developed quadratic regression model

利用Design expert V7.0.0統(tǒng)計軟件通過逐步回歸對表2試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到杜衡揮發(fā)油得率對以上三個因素的二次多項回歸模型為：

對該模型進行方差分析，結果見表3。由表3可見，模型極顯著(P＜0.01)，失擬項(P＞0.05)不顯著以及R2Adj=0.9179和RSN(信噪比)為12.823≥4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗誤差較小，故可用此模型對微波提取杜衡揮發(fā)油的工藝結果進行分析和預測。2.2.2響應曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程的響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析液料比、微波功率和微波時間對得率的影響。其響應曲面及其等高線如圖5所示，3組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。

圖5 各因素交互作用對得率影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of pairwise interactions of three operating parameters on volatile oil yield

等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。比較3組圖并結合表3中P值可知：模型的一次項x2(P＜0.05)和x3(P＜0.05)顯著、x1(P＞0.05)不顯著；交互項x1x2(P＜0.05)顯著，其他各交互項都不顯著；二次項x12(P＜0.05)顯著，其他二次項都極顯著，表明各影響因素對杜衡揮發(fā)油得率的影響不是簡單的線性關系。

為進一步確定最佳提取工藝參數(shù)，對所得方程進行逐步回歸，刪除不顯著項，然后求一階偏導，并令其為0，可得最佳工藝參數(shù)為液料比8.3:1(mL/g)、微波功率309W和微波時間154s，此時杜衡揮發(fā)油得率為7.90%。

2.2.3 驗證實驗

為檢驗Box-Behnken試驗設計所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)提取3次，實際測得的平均得率為7.96%，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.76%。因此，基于Box-Behnken試驗設計所得的最佳工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

2.3 杜衡揮發(fā)油化學成分的氣相色譜-質譜聯(lián)用分析

圖6 微波輔助提取杜衡揮發(fā)油的氣相色譜-質譜聯(lián)用分析總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of volatile oil extraction from Asarum forbesii Maxim by optimized microwave-assisted method

表4 杜衡揮發(fā)油化學成分的分析結果Table 4 Chemical composition of volatile oil from Asarum forbesii Maxim

取最佳提取工藝參數(shù)下的杜衡揮發(fā)油適量按上述氣相色譜-質譜聯(lián)用分析條件，通過氣質聯(lián)用儀對杜衡揮發(fā)油化學成分進行分析，各分離組分利用計算機譜庫(NIST 05)進行檢索和有關文獻進行人工譜圖解析，采用色譜峰面積歸一化法進行相對定量[13-15]。從杜衡揮發(fā)油中共分離出25個峰，確定了其中的19種化合物，所鑒定成分占總揮發(fā)油的95.64%，經(jīng)氣相色譜面積歸一化法測定了各組分的相對含量，分析鑒定結果見圖6和表4。相對含量在1%以上的有9種化合物，占總化合物的89.85%，其中相對含量最高的是甲基丁香酚，占35.76%，其次是橄香素，占22.77%，居第三位的是細辛脂素，占12.78%。在已鑒定出的19種化合物與文獻[8-10]報道既有相似的地方也有一定的區(qū)別的，原因可能是原料產(chǎn)地不同也有可能是由提取方法不同造成的。

3 結 論

3.1 在單因素試驗基礎上建立一個以杜衡揮發(fā)油提取得率為目標值，以液料比、微波功率和微波時間為因素的數(shù)學模型，方差分析表明擬合較好。通過對回歸方程優(yōu)化計算，得到提取的最佳工藝條件為液料比8.3:1 (mL/g)、微波功率309W和微波時間154s。對所建立的數(shù)學模型進行驗證實驗，在最優(yōu)條件下，得到杜衡揮發(fā)油得率為7.96%，與理論值7.90%基本一致。

3.2 從杜衡揮發(fā)油中共分離出25個峰，確定其中的19種化合物，所鑒定成分占總揮發(fā)油的95.64%，經(jīng)氣相色譜面積歸一化法測定各組分的相對百分含量，其中相對含量最高的是甲基丁香酚，占35.76%，其次是橄香素，占22.77%，居第3位的是細辛脂素占12.78%。

[1]吳貽谷. 中藥大辭典[M]. 上海: 上海科學技術出版社, 1986: 1034.

[2]YOUN Y S, MING Y K, YUAN S C. Microwave-assisted extraction of ginsenosides from ginseng root[J]. Microchemical Journal, 2003, 74(2): 131-139.

[3]GIRIJA R, VILAS G G. Microwave-assisted extraction of piperine from Piper nigrum[J]. Industrial and Engineering Chemistry Research, 2002, 41(10): 2521-2528.

[4]GONG Shengzhao, CHENG Jiang, YANG Zhuoru. Microwave-assisted extraction of isoflavones from Belamcanda chinensis[J]. Chinese Journal of Chemical Engineering, 2005, 13(4): 556-559.

[5]李超, 鄭義, 王衛(wèi)東, 等. 響應曲面法優(yōu)化牛蒡籽油的微波提取工藝研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(2): 189-192.

[6]李超, 王衛(wèi)東. 響應曲面法優(yōu)化葡萄籽油的微波提取工藝研究[J]. 糧油加工, 2010(1): 3-7.

[7]李超, 王衛(wèi)東, 孫月娥. 響應曲面法優(yōu)化韭菜籽油的微波提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(7): 283-286.

[8]王占彬, 代義強, 朱世康. 微波輔助提取刺槐種子中黃酮類化合物的工藝參數(shù)優(yōu)化[J]. 食品科學, 2008, 29(8): 241-244.

[9]黃璞, 謝明勇, 聶少平, 等. 響應曲面法優(yōu)化微波輔助提取黑靈芝孢子多糖工藝研究[J]. 食品科學, 2007, 28(10): 200-203.

[10]胡慶國. 微波法提取桑葉黃酮工藝條件的研究[J]. 淮北煤師院學報, 2003, 24(2): 32-34.

[11]HAO Jinyu, HAN Wei, SHI Chaoou, et al. Microwave-assisted extraction of artemisinin from Artemisiaannua L[J]. Separation and Purification Technology, 2002, 28(3): 191-196.

[12]XIAO Weihua, HAN Lujia, SHI Bo. Microwave-assisted extraction of flavonoids from Radix Astragali[J]. Separation and Purification Technology, 2008, 62(3): 614-618.

[13]陳健, 潘藝, 林慶生. CO2超臨界流體萃取法提取杜衡揮發(fā)油化學成分的分析[J]. 中國藥房, 2007, 18(36): 2841-2843.

[14]潘炯光, 徐植靈, 王光輝, 等. 中國細辛屬植物揮發(fā)油的氣相色譜-質譜分析漢城細辛、杜衡、燈籠細辛、鼎湖細辛和花葉尾花細辛[J]. 中藥通報, 1984, 9(4): 31-33.

[15]張峰, 徐青, 付紹平, 等. 杜衡揮發(fā)油的化學成分研究[J]. 中草藥, 2004, 35(11): 1215-1217.

Microwave-assisted Extraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of Volatile Oil from Asarum forbesii Maxim

LI Chao，WANG Nai-xin，ZHENG YI，YAN Mao-fei，LI Jiao-jiao
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

The optimization of the extraction of volatile oil from Asarum forbesii Maxim with microwave assistance was studied through one-factor-at-a-time instigations followed by mathematical modeling for extraction efficiency as a response to liquid-tosolid ratio, microwave power and treatment time based on the principle of Box-Behnken experimental design and response surface analysis of model. Liquid-to-solid ratio of 8.3:1, microwave power of 309 W and treatment time of 154 s were found optimum for the extraction of volatile oil with ethyl acetate, which was selected out of four common organic solvents based on oil yield. Under these conditions, the experimental value of oil yield was 7.96%, substantially complying with the theoretical value. This indicates good reliability of the developed regression model in predicting oil yield. The volatile oil extracted by the optimized method was subjected to separation and identification on a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) system. A total of 25 constituents were separated and 19 of them were identified and quantified by area normalization method. This study can provide useful references for the development and exploitation of Asarum forbesii Maxim.

microwave-assisted extraction；Asarum forbesii Maxim；volatile oil；response surface methodology；gas chromatography-mass spectrometry

TS224.4

A

1002-6630(2011)04-0121-05

2010-03-28

徐州工程學院青年項目(XKY2009121)

李超(1978—)，男，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：chaoge002@163.com