王騰宇，王銘義，宋玉卿，胡立志，于殿宇,*

響應(yīng)面法優(yōu)化生物酶法合成植物甾醇酯

王騰宇1，王銘義2，宋玉卿1，胡立志1，于殿宇1,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱理工大學(xué)測(cè)控技術(shù)與通信工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086)

采用Novozym 435脂肪酶催化大豆油與植物甾醇的酯交換反應(yīng)，對(duì)其技術(shù)參數(shù)和條件進(jìn)行探索。通過(guò)單因素與響應(yīng)面分析，確定最佳工藝參數(shù)：反應(yīng)溫度101℃、酶用量1%、甾醇添加量5.2%、反應(yīng)時(shí)間3h。在最佳條件下酯交換反應(yīng)的轉(zhuǎn)換率高達(dá)85.67%。

植物甾醇；大豆油；酯交換反應(yīng)；脂肪酶

甾醇又被稱為類固醇，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等[1-2]與膽固醇極其相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，僅僅側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同。自從植物油中發(fā)現(xiàn)谷甾醇等植物甾醇以來(lái)，近百年中，人們對(duì)植物甾醇進(jìn)行了廣泛深入的探討，甾醇也被譽(yù)為“生命的鑰匙”[3]。近年研究表明，植物甾醇是一類具有生理活性的物質(zhì)，其生理功能十分重要，如降膽固醇、抗癌作用、類激素功能、抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、抗病毒等[4]。因此，植物甾醇及其制品被廣泛地運(yùn)用于動(dòng)物生長(zhǎng)劑、植物生長(zhǎng)激素的合成，乃至醫(yī)藥、食品、化妝品和紡織等各個(gè)領(lǐng)域[5]。

植物甾醇可抑制膽固醇的吸收，達(dá)到降低膽固醇的效果[6]。相關(guān)研究對(duì)植物甾醇進(jìn)行系統(tǒng)毒理性評(píng)價(jià)表明，植物甾醇在小腸內(nèi)的吸收性很差(1%～10%)[7-8]。雖然植物甾醇具有降低血清膽甾醇水平的功效，但游離植物甾醇在水和油脂中的低溶解性限制了它在食品中的實(shí)際作用[9]，導(dǎo)致其在人體內(nèi)的溶解性和生物利用性較差[10-12]。植物甾醇在C3位上的羥基是一個(gè)十分重要的活性基團(tuán)，易與油脂中的甘三酯發(fā)生酯化反應(yīng)生成植物甾醇酯，植物甾醇酯有著更優(yōu)的脂親和性和更佳的降膽固醇效果[13]。例如：植物甾醇酯化后顯著改善了溶解度，游離的植物甾醇21℃時(shí)在食用油或脂肪中的溶解度僅為2%，而甾醇酯的溶解度高達(dá)35%～40%[14]。臨床實(shí)驗(yàn)表明，成人每天只要攝入1.3g以上植物甾醇酯即可達(dá)到降低膽固醇的目的[15]。

目前，甾醇酯的合成方法有化學(xué)法和酶法兩種[16]。與化學(xué)法相比，酶法反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少[17]。本研究采用大豆油與植物甾醇為反應(yīng)原料，選擇生物酶法在無(wú)溶劑體系中合成植物甾醇的工藝進(jìn)行探索，旨在為油脂制品的產(chǎn)業(yè)化提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

植物甾醇 西安藍(lán)天生物工程有限責(zé)任公司；大豆油 黑龍江九三糧油工業(yè)集團(tuán)；Novozym 435脂肪酶 丹麥Novozymes公司；其他試劑均為化學(xué)純。

HSY-2MB型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪高科儀器廠；LD4-2A低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物甾醇酯的合成

精確稱量一定量的植物甾醇、大豆油和Novozym 435脂肪酶，連同轉(zhuǎn)子一同加入錐形瓶中，置于集熱式磁力攪拌器中，調(diào)整溫度、攪拌速度，反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)完成后，在3000～4000r/min條件下離心20min，取出上層油脂制品(即為含有植物甾醇酯的油脂)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將甾醇溶解于乙酸酐中，配制成100μg/mL的溶液并吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL分別置于10mL試管內(nèi)，在各管內(nèi)加入乙酸酐使總體積均達(dá)到4mL。加入2滴濃硫酸，30min后，在660nm波長(zhǎng)處比色。以甾醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為y=0.0224x＋0.041，R2=0.9956。

1.2.3 轉(zhuǎn)換率的測(cè)定

將制取的植物甾醇酯3～4滴，置于25mL試管內(nèi)，準(zhǔn)確記錄其質(zhì)量。加入4mL無(wú)水乙醇、0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的氫氧化鉀溶液，在65℃恒溫水浴中皂化1h。皂化時(shí)每隔20～30min振搖一次使其皂化完全。皂化完畢，取出試管，冷卻。加入3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的氯化鈉溶液，10mL石油醚，蓋緊玻塞，在電動(dòng)振蕩器上振搖2min，靜置分層(一般約需1h以上)。

取上層石油醚液2mL，置于10mL試管內(nèi)，在65℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，加?mL乙酸酐，2滴濃硫酸，混勻，靜置20min后在660nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)得吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的植物甾醇含量。

1.2.4 轉(zhuǎn)換率計(jì)算

式中：X為轉(zhuǎn)換率/%；M為測(cè)得的吸光度在甾醇標(biāo)準(zhǔn)線上查得的甾醇含量/μg；V為石油醚總體積/mL；V1為取出的石油醚體積/mL；m1為稱取油樣品的質(zhì)量/g；m2為每克稱取油脂樣品中植物甾醇量/mg；m3為油脂樣品量/g；m4為添加的植物甾醇量/mg；1/100000為折算成每1g油脂制品植物甾醇酯毫克數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響

在植物甾醇添加量5%、酶用量1%、反應(yīng)時(shí)間3h、攪拌速度600r/min條件下，考察不同溫度對(duì)甾醇轉(zhuǎn)換率的影響。Novozym 435脂肪酶的最佳反應(yīng)溫度在70～80℃之間，高溫會(huì)使酶變性失活，由于在超臨界狀態(tài)下物質(zhì)的理化特性發(fā)生很大變化，所以在較高溫度下酶也可以保證其活性。油脂中含有微量的水分，過(guò)低的水分可使酶的耐高溫程度增加，甘三酯的酯交換反應(yīng)是在含水量非常低的條件下反應(yīng)。因此，Novozym 435脂肪酶可耐受一定程度的高溫而不變性。從圖1可以看出，在80～100℃范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)換率隨著反應(yīng)溫度的升高而增加，但是在100～120℃這一區(qū)間轉(zhuǎn)換率開(kāi)始下降。這是因?yàn)槊傅幕钚詴?huì)隨著溫度的上升而增大，達(dá)到最適溫度以后，再升高溫度反而會(huì)使酶變性失活，從而使轉(zhuǎn)換率下降。因此，選擇反應(yīng)溫度為100℃。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on transesterification rate

2.1.2 甾醇添加量對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響

在酶用量1%、反應(yīng)時(shí)間3h、反應(yīng)溫度100℃、攪拌速度600r/min條件下，考察不同甾醇添加量對(duì)甾醇酯交換的影響。從圖2可以看出，植物甾醇的添加量為5%時(shí)轉(zhuǎn)換率最高。隨著植物甾醇添加量繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)換率呈下降趨勢(shì)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物甾醇添加量過(guò)低時(shí)反應(yīng)并不完全，超過(guò)15%以后，植物甾醇不能很好地溶解于大豆油中。因此，5%為最佳甾醇添加量。

圖2 植物甾醇添加量對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響Fig.2 Effect of phytosterol amount on transesterification rate

2.1.3 酶用量對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響

植物甾醇添加量5%、反應(yīng)時(shí)間3h、反應(yīng)溫度100℃、攪拌速度600r/min條件下，考察不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)甾醇轉(zhuǎn)換率的影響。從圖3可以看出，酶用量1.0%時(shí)轉(zhuǎn)換率最大，隨著酶用量繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)換率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)?，酶的用量過(guò)小，不能使底物完全與其活性中心結(jié)合，造成底物的浪費(fèi)；酶用量過(guò)大，造成酶聚集在一起使其與底物接觸面積相對(duì)減小，并且產(chǎn)物與酶結(jié)合在一起不利于產(chǎn)品的精煉。因此，選擇酶用量1.0%為最佳條件。

圖3 不同酶用量對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on transesterification rate

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響

在植物甾醇添加量5%、酶用量1%、反應(yīng)溫度100℃、攪拌速度600r/min條件下，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)甾醇轉(zhuǎn)換率的影響。從圖4可以看出，3h以后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)換率增加并不十分明顯，并且反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)生的水分會(huì)使反應(yīng)向反方向進(jìn)行，降低反應(yīng)效率。從節(jié)省資源，減少副產(chǎn)物角度來(lái)看，選擇反應(yīng)時(shí)間3h。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響Fig.4 Effect of reaction time on transesterification rate

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選取反應(yīng)溫度、酶用量和甾醇添加量3個(gè)因素為自變量(xi)以植物甾醇酯的轉(zhuǎn)換率為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共23個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。各因素的變化區(qū)間由預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)做3個(gè)平行樣試驗(yàn)，取其平均值。因素水平編碼表見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 生物酶法合成植物甾醇酯響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Variables and their coded levels in quadratic orthogonal rotary combination design

表2 生物酶法合成植物甾醇酯響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Scheme of experimental results of quadratic orthogonal rotary combination design

經(jīng)過(guò)SAS8.0軟件分析后得出合成植物甾醇酯的回歸方程為：

Y=90.50327066-1.33390461x1-1.20254077x2-2.54236122x3＋0.31250000x1x2＋0.31250000x1x3＋0.43750000x2x3-3.32006136x12-1.74713631x22-1.53505653x32

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression equation for transesterification rate

回歸方程的方差分析見(jiàn)表3。表3中P=0.0007＜0.05，表明回歸方程差異顯著，回歸方程擬合較好。

2.2.2 酶用量和甾醇添加量對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響

圖5 酶用量(x2)和甾醇添加量(x3)對(duì)轉(zhuǎn)換率(Y)的影響Fig.5 Response surface of the effects of enzyme amount and phytosterol amount on transesterification rate

由圖5可知，在選取的條件范圍內(nèi)，當(dāng)反應(yīng)溫度在0水平時(shí)，酶用量不變，隨著甾醇添加量的逐漸增大，轉(zhuǎn)換率逐漸升高，當(dāng)達(dá)到一定值后升高速度緩慢，最后略有下降；當(dāng)甾醇添加量不變時(shí)，隨著酶用量的增加，轉(zhuǎn)換率先增高，當(dāng)達(dá)到一定值后，有所下降。由等高線圖可知：轉(zhuǎn)換率的極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在84%～87%之間，在適宜的酶用量和適當(dāng)?shù)溺薮继砑恿浚玫降霓D(zhuǎn)換率較高，綜合兩個(gè)圖得出酶用量范圍在1.00%～1.03%之間，甾醇添加量在5.12%～5.30%之間時(shí)，極值可取到84%～86%。

2.2.3 反應(yīng)溫度和甾醇添加量對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響

由圖6可知，在選取的條件范圍內(nèi)，當(dāng)酶用量在0水平時(shí)，反應(yīng)溫度不變，隨著甾醇添加量的增加，轉(zhuǎn)換率逐漸升高，當(dāng)達(dá)到一定值后開(kāi)始下降；當(dāng)甾醇添加量不變時(shí)，隨著酶用量的增加，轉(zhuǎn)換率逐漸升高，當(dāng)達(dá)到一定值后升高速度緩慢，最后略有下降。由等高線圖可知：轉(zhuǎn)換率的極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在84%～87%之間，在適宜的反應(yīng)溫度和適當(dāng)?shù)溺薮继砑恿康玫降霓D(zhuǎn)換率較高，綜合兩個(gè)圖得出反應(yīng)溫度范圍在100.00～101.20℃之間，甾醇添加量在5.18%～5.30%之間時(shí)，極值可取到84%～86%。

圖6 反應(yīng)溫度(x1)和甾醇添加量(x3)對(duì)轉(zhuǎn)換率(Y)的影響Fig.6 Response surface of the effects of reaction temperature and phytosterol amount on transesterification rate

2.2.4 反應(yīng)溫度和酶用量對(duì)轉(zhuǎn)換率的影響

圖7 反應(yīng)溫度(x1)和酶用量(x2)對(duì)轉(zhuǎn)換率(Y)的影響Fig.7 Influence of reaction temperature and lipase dosage on conversion rate

由圖7可知，在選取的條件范圍內(nèi)，當(dāng)甾醇添加量在0水平時(shí)，反應(yīng)溫度不變，隨著酶用量的增加，轉(zhuǎn)換率先升高后下降；當(dāng)酶用量不變時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的提高，轉(zhuǎn)換率先升高到一定值后略有下降。由等高線圖可知：脫色率的極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在84%～87%之間，在適宜的反應(yīng)溫度和適當(dāng)?shù)拿赣昧織l件下得到的轉(zhuǎn)換率較高，綜合兩個(gè)圖得出反應(yīng)溫度范圍在100.00～101.20℃之間，酶用量在1.00%～1.02%之間時(shí)，極值可取到84%～86%。

通過(guò)等高線分析，結(jié)合實(shí)際條件，得到合成植物甾醇酯的最優(yōu)反應(yīng)條件為x1=-0.1392、x2=-0.0992、x3=-0.3318，即反應(yīng)溫度100.83℃、酶用量1.01%、甾醇添加量5.19%。將此最優(yōu)條件組合代入二次回歸方程中，計(jì)算出生物酶法合成植物甾醇酯的轉(zhuǎn)換率為85.45%。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備所限，取反應(yīng)溫度101℃、酶用量1%、甾醇添加量5.2%，按照上述最優(yōu)組合在反應(yīng)3h條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到植物甾醇的轉(zhuǎn)換率為85.67%，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間的良好擬合性，證實(shí)了模型的有效性。表明所得出的回歸方程可以很好的體現(xiàn)反應(yīng)溫度、酶用量和甾醇添加量與轉(zhuǎn)換率之間的關(guān)系，為植物甾醇合成產(chǎn)業(yè)化提供直接的參考依據(jù)。

3 結(jié) 論

對(duì)生物酶法合成植物甾醇酯工藝進(jìn)行深入研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析相結(jié)合，對(duì)反應(yīng)溫度、酶用量，甾醇添加量等植物甾醇酯的主要因素進(jìn)行考察。得到植物甾醇酯合成的最佳工藝參數(shù)：反應(yīng)溫度101℃、酶用量1%、甾醇添加量5.2%，按照此參數(shù)反應(yīng)3h，得到的植物甾醇轉(zhuǎn)換率為85.67%?？蔀橹参镧薮贾破返漠a(chǎn)業(yè)化提供一定的參考。

[1]FERNANDES P, CABRAL J M S. Phytosterols: applicationsand recovery methods[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(12): 2335-2350.

[2]KRITCHEVSKY D, CHEN S C. Phytosterols: health benefits and potential concerns: a review[J]. Nutr Res, 2005, 25(5): 413-428.

[3]許文林, 沙鷗, 錢(qián)俊紅, 等. 混合植物甾醇中豆甾醇和β-谷甾醇的高效液相色譜分析[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2003, 22(6): 98-100.

[4]曹萬(wàn)新, 孟橘, 陳吉江, 等. 精煉過(guò)程中玉米油甾醇含量的變化[J].中國(guó)油脂, 2009, 34(8): 16-18.

[5]周寶蘭. 植物甾醇的應(yīng)用[J]. 中國(guó)油脂, 1992(4): 33-38.

[6]賈代漢, 周巖民, 王恬. 植物甾醇降膽固醇作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)油脂, 2005, 30(5): 55-58.

[7]WAALKENS-BERENDSEN D H, WOLTERBEEK A P M, WIJNANDS M V W, et al. Safety evaluation of phytosterol esters. Part 3. Two-generation reproduction study in rats with phytosterol esters: a novel functional food[J]. Food Chem Toxical, 1999, 37(7): 683-696.

[8]陳茂彬, 黃琴, 吳謀成. 植物甾醇油酸酯產(chǎn)品的合成工藝研究[J]. 中國(guó)油脂, 2005, 30(6): 63-65.

[9]EEGEL R, SCHUBERT H. Formulation of phytosterols in emulsions for increased dose response in functional foods[J]. Innov Food Sci Emerging Technol, 2005, 6(2): 233-237.

[10]ZAWISTOWSKI J. Method of preparing microparticles of phytosterols or phytostanols: EP, 1148793[P]. 2003-08-13.

[11]HICKS K B, MOREAU R A. Phytosterols and phytostanols: functional food cholesterol busters[J]. Food Technology, 2001, 55(1): 63-67.

[12]陳茂彬, 黃琴. 植物甾醇乙酸酯和植物甾醇油酸酯抗腫瘤作用初探[J]. 中國(guó)油脂, 2003, 28(9): 49-51.

[13]JANDACK R J, WEBB M R, MATTSON F H. Effect of an aqueous pheas on the solubility of cholesterol in an oil phase[J]. Journal of Lipid Research, 1997, 18: 203-210.

[14]LEES A M, MOK H Y, LEES R S, et al. Plant sterols as cholesterollowering agents[J]. Atherosclerosis, 1977, 28(2): 325-328.

[15]WESTSTRATE J A, AYESH R, BAUER-PLANK C, et al. Safety evaluation of phytosterol esters. Part 4. Faecal concentrations of bile acids and neutral sterols in healthy normolipidaemic volunteers consuming a controlled diet either with or without a phytosterol ester-enriched margarine[J]. Food Chem Toxical, 1999, 37(11): 1063-1071.

[16]董緒燕, 孔凡丕, 袁鋼友, 等. 無(wú)溶劑系統(tǒng)微波法合成甾醇油酸酯的研究[J]. 中國(guó)油脂, 2009, 34(7): 30-33.

[17]裘愛(ài)泳, 劉軍海. 酶催化合成植物甾醇酯和植物甾烷醇酯[J]. 中國(guó)油脂, 2003, 28(6): 25-27.

Applying Response Surface Methodology to Optimize the Lipase-catalyzed Synthesis of Phytosterol Ester

WANG Teng-yu1，WANG Ming-yi2，SONG Yu-qing1，HU Li-zhi1，YU Dian-yu1,*
(1. School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. School of Measurement-control Technology and Communication Engineering, Harbin University of Science and Technology, Harbin 150086, China)

Transesterification was conducted in soybean oil with phytosterol under the catalysis of Novozym 435 lipase. The optimum reaction conditions were obtained by single factor experiments and response surface analysis to be reaction between soybean oil and added phytosterol at a concentration of 5.2% for 3 h at 101 ℃ in the presence of 1% lipase. The rate of transesterification was 85.67% under these conditions.

phytosterol；soybean oil；transesterification；lipase

TQ645.98

A

1002-6630(2011)04-0059-05

2010-09-01

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA101503)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(11551064)

王騰宇(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z油加工。E-mail：wangtengyu@yahoo.cn

*通信作者：于殿宇(1964—)，男，教授，博士研究生，研究方向?yàn)榇蠖褂椭庸ぜ夹g(shù)。

E-mail：dyyu2000@yahoo.com.cn