陳 兵，李健波，楊俊興，阮周曦，孫 潔，張彩虹，劉建利，花群義＊，周曉黎

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳518001；2.云南出入境檢驗檢疫局，云南昆明650228）

鹿流行性出血病病毒雙抗夾心ELISA方法的建立

陳 兵1，李健波1，楊俊興1，阮周曦1，孫 潔1，張彩虹1，劉建利1，花群義1＊，周曉黎2

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳518001；2.云南出入境檢驗檢疫局，云南昆明650228）

為建立鹿流行性出血病病毒（EHDV）病原學(xué)檢測方法，用純化的抗EHDV特異性單克隆抗體包被ELISA板，用兔抗EHDV IgG作為夾心抗體，IgG作為夾心抗體建立EHDV雙抗夾心ELISA方法，并對該方法的特異性和敏感性進行了試驗。用ELISA分別檢測EHDV、藍舌病病毒（BTV）、水皰性口炎病毒（VSV）、赤羽病病毒（AKV）、小反芻獸疫病毒（PPRV）樣品，用RT－PCR作對照。結(jié)果表明，ELISA具有良好的特異性和敏感性。用夾心ELISA和RT－PCR同時檢測128份參考樣品，結(jié)果表明夾心ELISA的特異性和敏感性分別為100%和96.3%，兩種方法的符合率為99.2%。本研究結(jié)果為EHDV檢測及鹿流行性出血病流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的工具。

鹿流行性出病；鹿流行性出病病毒；雙抗體夾心ELISA；單克隆抗體

＊通訊作者

鹿流行性出血?。‥pizootic hemorrhagic disease of deer，EHD）是由鹿流行性出血病病毒（EHDV）引起的，以引起白尾鹿體溫升高、黏膜和漿膜廣泛出血并常處于昏迷狀態(tài)下死亡為特征的致死性蟲媒傳染病，牛和羊也可以感染發(fā)病。流行期時，此病危害較大，嚴重影響畜牧業(yè)和國際貿(mào)易的發(fā)展［1］。由于EHDV在周邊國家（如日本、朝鮮）都曾暴發(fā)過，存在EHDV傳入我國的風(fēng)險。因此，EHD是我國進出口貿(mào)易中需要監(jiān)測的重要疫病。

EHDV屬呼腸病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Obivirus），是節(jié)肢動物源（主要是庫蠓）的雙股RNA病毒［2］。EHDV由10個片段（1～10）組成，編碼7個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1－7）和3個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3A）［3］。VP7蛋白是 EHDV 的群特異性抗原，由S7基因編碼，基因全長1 162bp，編碼349個氨基酸殘基［4］。

目前，常用的EHDV檢測方法有瓊脂擴散試驗（AGID）和RT－PCR方法［5］。由于EHDV與BTV之間有很強的免疫學(xué)交叉反應(yīng)［6］，因此，AGID的特異性很差。本研究中用EHDV特異性單克隆抗體包被ELISA板，用于捕獲EHDV，用兔抗EHDV IgG作為夾心抗體，建立了檢測EHDV雙夾心ELISA方法。通過對EHDV陽性樣品、陰性樣品、其他病毒陽性樣品及參考樣品的檢測，結(jié)果表明該ELISA方法具有良好的特異性和敏感性，該方法可以用于EHDV快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞株及實驗動物 EHDV（血清1型～8型）、藍舌病病毒（BTV）1、3、10和17血清型、新澤西型水皰性口炎病毒（VSV－NJ）、赤羽病病毒（AKV）、小反芻獸疫病毒（PPRV）等滅活抗原（經(jīng)BHK－21細胞增殖）和BHK－21細胞均由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心動檢實驗室保存。3月齡新西蘭家兔購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑、材料及試劑盒 HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為Sigma公司產(chǎn)品，可溶型單組分TMB底物溶液為 Millipore公司產(chǎn)品，96孔（8孔×12條）ELISA微孔板為Costa公司產(chǎn)品，蛋白A/G抗體純化試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品。

1.1.3 單克隆抗體 鼠源抗EHDV單克隆抗體（1A5和8H6），由本實驗室先前制備并保存［7］。經(jīng)實驗驗證2株單克隆抗體具有良好的特異性，與BTV、VSV、AKV、PPRV無交叉反應(yīng)性。2株單克隆抗體（1A5和8H6）腹水效價分別為1∶1 024 000和1∶2 048 000。經(jīng)抗體亞型鑒定，1A5和8H6均屬于IgG1，輕鏈均為κ。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體的純化 將腹水用蛋白A/G抗體純化化試劑盒進行純化，用DU－600核酸蛋白分析儀測定蛋白含量，用50mmol/L PBS（pH7.2）將純化的IgG稀釋至1mg/mL，置－70℃保存?zhèn)溆谩?A5和8H6，以等比例混合后包被96孔ELISA板。1.2.2 兔抗EHDV IgG的制備及純化 用差速離心和蔗糖梯度離心法對經(jīng)BHK－21細胞增殖的EHDV（血清1型，經(jīng)甲醛滅活）進行純化［8］，并用PBS稀釋至2mg/mL。用純化的EHDV免疫接種3月齡新西蘭家兔，每隔2周免疫接種1次，共免疫接種4次，前3次注射劑量為EHDV抗原1mg，第4次注射劑量為EHDV抗原2mg。首免時加等體積弗氏完全佐劑乳化，二免和三免時加等體積弗氏不完全佐劑乳化［9－10］。最后一次免疫后15d，經(jīng)耳靜脈采血并分離血清，間接ELISA檢測抗體效價。若效價達到1∶5 000以上，通過頸動脈放血，分離血清。蛋白A/G抗體純化試劑盒純化IgG，用DU－600核酸蛋白分析儀測定蛋白含量，將其稀釋至1mg/mL，于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙抗夾心ELISA的建立 用碳酸鹽緩沖液（Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，H2O 1 000mL，pH9.6）將純化后的抗EHDV單克隆抗體（1A5和8H6）稀釋至0.01mg/mL（由方陣滴定試驗得出的最佳包被濃度，詳細數(shù)據(jù)本文未列出），包被ELISA板（50uL/孔），4℃ 過夜，用洗滌液 （含 5mL/L Tween－20的PBS，PBST，pH7.2，）洗3次。加入30 mg/mL BSA溶液（200μL/孔），37℃封閉1h。用PBST洗3次，加入待檢樣品50μL/孔，同時用BHK細胞培養(yǎng)物作為陰性對照，37℃反應(yīng)30min，加入1∶500稀釋的兔抗EHDV IgG，50μL/孔，37℃反應(yīng)30min，用PBST洗3次，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃反應(yīng)30min，用PBST洗3次，最后加入底物溶液，50μL/孔，室溫反應(yīng)10min，用0.2mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，檢測OD450值。

1.2.4 ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 用建立的ELISA檢測30份EHDV陰性樣品，測定OD450值，計算平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），以O(shè)D450值X＋2SD作為陽性和陰性的分界線。

1.2.5 ELISA方法的特異性 用建立的ELISA分別檢測EHDV（血清1型～8型）標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品（滅活抗原）各10份和其他病毒陽性樣品（滅活抗原）及陰性樣品各10份，評價ELISA的特異性。

1.2.6 參考樣品檢測 128份參考樣品為本實驗室保存的經(jīng)BHK增殖EHDV陽性樣品、其他病毒陽性樣品及陰性樣品（多種正常同細胞培養(yǎng)物）。檢測時，用超聲波將收集細胞培養(yǎng)物破碎，離心后取上清用ELISA檢測，同時用PT－PCR作為對照，來評價ELISA的相對特異性和敏感性及ELISA與RTPCR檢測結(jié)果的符合率。

1.2.7 重復(fù)性試驗 從同一批試劑盒隨機取5個，分別檢測5份陽性樣品（滅活抗原）和5份陰性樣品，計算批內(nèi)變異系數(shù)。批間重復(fù)性試驗用4批試劑盒同時檢測5份標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品（滅活抗原）和5份陰性樣品，計算批間變異系數(shù)。

1.2.8 RT－PCR方法 根據(jù)EHDV NS3基因設(shè)計EHDV特異引物［11］，上游引物和下游引物序列分別為 5′－CGTGTAGAGTTGACAGCG－3 和 5－TGTCACACTCATTCGTAC－3′。用 Trizol提取法提取RNA，用寶生物工程（大連）有限公司一步法RTPCR試劑盒進行擴增。PCR反應(yīng)體系為25μL，擴增程序為45℃反轉(zhuǎn)錄60min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，40個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)完成后，取10μL PCR產(chǎn)物，于15g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

用ELISA檢測30份EHDV陰性樣品，測定OD450值，平均值為0.183，標(biāo)準(zhǔn)差為0.031，根據(jù)公式X＋2SD計算，陽性和陰性結(jié)果判定的臨界值為0.245（詳細數(shù)據(jù)本文未列出）。

2.2 ELISA特異性試驗結(jié)果

用ELISA分別檢測EHDV（血清1型～8型）標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品各10份，結(jié)果全為陽性。用ELISA試劑盒檢測BTV（血清1、3、10和17型）、VSV－NJ、PPRV、AKV陽性樣品各10份及陰性樣品10份，結(jié)果全為陰性，表明該ELISA具有良好的特異性（表1）。

2.3 重復(fù)性試驗結(jié)果

從同一批ELISA試劑盒（20100925）中隨機取5個分別對10份樣品進行檢測，結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)在2.48%～8.51%之間（表2），表明ELISA批內(nèi)重復(fù)性良好。用4批ELISA試劑盒（20100925、20101030、20101208和20110215）同時檢測10份樣品，結(jié)果批間變異系數(shù)在4.10%～8.77%之間（表3），表明ELISA批間重復(fù)性良好。

2.4 參考樣品檢測結(jié)果

用建立的ELISA和RT－PCR檢測參考樣品128份，其中ELISA檢測26份陽性樣品，102份為陰性；RT－PCR檢測27份為陽性，101份為陰性。26份兩種方法檢測均為陽性，101份兩種方法檢測均為陰性。特異性為（101/101）×100%＝100%；敏感性為（26/27）×100%＝96.3%；符合率為［（26＋101）/128］×100%＝99.2%。計算得出 ELISA 的特異性和敏感性分別為100%和96.3%；兩種方法檢測結(jié)果的符合率為99.2%（表4）。

表1 特異性試驗結(jié)果Table 1 Results of specificity test

表2 批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Results of reproducibility tests within a batch

表3 批間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Results of reproducibility tests among batches

表4 臨床樣品檢測結(jié)果Table 4Results of reference samples tested by ELISA and RT－PCR

3 討論

本研究選用前期自行制備的抗EHDV特異性單克隆抗體（1A5和8H6）作為第一抗體，包被96孔ELISA板，用于捕獲樣品中的EHDV，用兔抗EHDV IgG作為第二抗體，建立了檢測EHDV雙抗夾心ELISA方法。通過對EHDV陽性樣品、陰性樣品、其他病毒陽性樣品和參考樣品進行檢測，并用RT－PCR作為對照方法，結(jié)果表明該方法具有很好的特異性和敏感性。

單克隆抗體是重要的免疫學(xué)工具，在病原的生物學(xué)特性、抗原性研究及病原的檢測、治療、免疫機制研究等方面均具有重要應(yīng)用價值。在建立病原學(xué)診斷方法中，單克隆抗體的特異性直接決定著所建立診斷方法的特異性。因此，在建立EHDV雙抗夾心ELISA方法時，作者選用單抗作為第一抗體包被ELISA板，來捕獲樣品中的抗原。也有學(xué)者用多抗作為第一抗體，在本研究中，作者曾試用兔抗EHDV IgG包被ELISA板，用抗EHDV單克隆抗體作為第二抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檢測時OD450值較低，可能是由于用多抗作為第一抗體與EHDV抗原反應(yīng)后，減少了與單克隆抗體結(jié)合的表位，導(dǎo)致抗原與第二抗體（單抗）結(jié)合的效率降低，在一定程度上降低檢測方法的敏感性［6］。

目前，常用的EHDV檢測的免疫方法是瓊脂擴散試驗方法，但由于EHDV和BTV之間存在較強的免疫學(xué)交叉反應(yīng)［6－7］。導(dǎo)致瓊脂擴散試驗的特異性較低。本研究中，使用EHDV特異性單克隆抗體包被ELISA板，用抗EHDV IgG作為夾心抗體建立了ELISA方法，檢測BTV（血清1、3、10和17型）時，沒有交叉反應(yīng)，表明本研究所建立方法的特異性優(yōu)于較瓊脂擴散試驗。因此，該方法可以用于EHDV檢測及EHD流行病學(xué)調(diào)查。另外，由于我國境內(nèi)目前還沒有EHD流行的報道，該ELISA方法可用于進口動物EHDV的檢測，有利于防止境外EHD傳入我國。

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Establishment of Sandwich ELISA for Epizootic Hemorrhagic Disease of Deer Virus

CHEN Bing1，LI Jian－bo1，YANG Jun－xing1，RUAN Zhou－xi1，SUN Jie1，ZHANG Cai－h(huán)ong1，LIU Jian－li1，HUA Qun－yi1，ZHOU Xiao－li2

（1.ShenzhenEntry－ExitInspectionandQuarantineBureau，Shengzhen，Guangdong，518001，China；
2.YunnanEntry－ExitInspectionandQuarantineBureau，Kunming，Yunnan，650228，China）

In order to establish an immunoassay for Epizootic hemorrhagic disease of deer virus（EHDV）detection，a double－antibody sandwich ELISA was developed based on purified monoclonal antibody against EHDV and rabbit anti EHDV polyclonal antibody.This ELISA was used to detect positive samples of EHDV，bluetongue virus（BTV），Vesicular stomatitis virus（VSV），Akabane disease virus（AKV）and Peste des petits ruminants virus（PPRV）and negative samples，and the results indicated that the ELISA had good specificity.This ELISA was also used to test 128reference samples，RT－PCR was used as a reference method，the results showed the specificity and sensitivity were 100%and 96.3%respectively，the agreement ratio between ELISA and RT－PCR was 99.2%.This ELISA is suitable for rapid detection of EHDV infection in ruminants.

Epizootic hemorrhagic disease；Epizootic hemorrhagic disease of deer virus；sandwich ELISA；monoclonal antibody

S854.43

A

1007－5038（2011）10－0001－05

2011－04－12

國家863計劃項目（2006AA10Z445）；中國博士后科學(xué)基金（20080430855）

陳 兵（1981－），男，河南沈丘人，獸醫(yī)師，主要從事進出口動物疫病檢測及外來動物傳染病免疫學(xué)方法研究。