王洪津，白艷娟,辛世萌

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116000)

缺血性腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病，而腦缺血再灌注損傷是治療缺血性腦血管病的一大難題。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是重要的生物活性因子之一，對神經(jīng)細胞的生長發(fā)育、分化、再生發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是參與損傷神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的重要因素，NGF可用于治療腦細胞損傷和各種神經(jīng)損傷[1]。本實驗利用經(jīng)典的MCAO模型，以免疫組化方法觀察腦缺血2 h再灌注不同時間點腦組織內(nèi)促凋亡因子Fas-L及抗凋亡因子p-PKB的表達，并觀察NGF對其表達的影響，探討NGF的神經(jīng)保護作用，為臨床應(yīng)用NGF治療腦梗塞提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠55只(大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，雌雄不限，體重200～250 g，清潔級，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21°C，自由進食水。

1.2 試劑和藥品

p-PKB兔抗體、Fas-L兔抗體，免疫組化SABC試劑盒，DAB顯色液，注射用NGF(購于博士德試劑公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組：隨機分為假手術(shù)組(n=5)(第1組)；對照組(n=30)，按缺血2 h再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h再分為6組(分別為2、3、4、5、6、7組)，每組5只；NGF(第8f組和8p組，分別為缺血2 h再灌注6 h和再灌注72 h注射NGF，每組5只)和生理鹽水對照組(第9f組和9p組，分別為再灌注6 h和再灌注72 h注射生理鹽水，每組5只)。

1.3.2 腦缺血再灌注模型制備(MCAO模型)：均采用線栓法行右側(cè)大腦中動脈局部腦缺血-再灌注模型。缺血2 h，再灌注時間點按分組要求。假手術(shù)組插入魚線后馬上抽出，余步驟同手術(shù)組。

1.3.3 NGF給藥方法：第8組大鼠于再灌注后5 min肌肉注射NGF(每100 g體重NGF500BU/0.1 mL)，第9組以同樣方法注入相同體積的無菌生理鹽水。

1.3.4 神經(jīng)功能缺損評分：按Zea Long 5分制標準評分：0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，不能伸展對側(cè)前爪；2分，行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。0分和4分者剔除。

1.3.5 免疫組織化學(xué)檢測法：標本及切片制備：各組大鼠在各自再灌注時間點后經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定，斷頭取腦，4%多聚甲醛外固定24 h，自視交叉處開始向后做冠狀切片，石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm,嚴格按試劑盒說明行Fas-L和p-PKB免疫組織化學(xué)染色。每張切片顯微鏡下分別隨機選取缺血區(qū)內(nèi)的4個視野，進行p-PKB陽性細胞和Fas-L陽性細胞計數(shù)。判斷標準：顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性細胞數(shù)，鏡下胞質(zhì)或胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，無棕黃色顆粒者為陰性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺失，缺血再灌注組神經(jīng)功能評分見表1。其中，NGF組(8組)與生理鹽水(9組)比較，神經(jīng)功能均明顯減輕(P<0.01)。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分

2.2 Fas-L蛋白的表達

假手術(shù)組大鼠有少量Fas-L蛋白表達(圖1)，主要分布于皮質(zhì)及海馬，缺血再灌注組Fas-L蛋白表達明顯增多，光鏡下胞漿呈棕黃色，染色較深，散在分布，尤以6 h組增多明顯(圖2)，24 h后逐漸下降，NGF組Fas-L蛋白表達較生理鹽水組明顯下降，染色較淡(圖3與圖4對比)。具體見表2。

2.3 p-PKB的表達

假手術(shù)組大鼠有少量p-PKB蛋白表達(圖5)，主要分布于皮質(zhì)及海馬，缺血再灌注組p-PKB蛋白表達明顯增多，光鏡下胞漿呈棕黃色，染色較深，散在分布，尤以72 h組增多明顯(圖6)， NGF組p-PKB蛋白表達較生理鹽水組明顯增加，染色較深(圖7與圖8比較)。具體見表3。

表2 各組Fas-L蛋白表達

表3 各組p-PKB蛋白表達

圖1 假手術(shù)組

圖2 6 h組

圖3 生理鹽水組

圖4 NGF組

圖5 假手術(shù)組

圖6 72 h組

圖7 生理鹽水組

圖8 NGF組

3 討 論

3.1 Fas-L凋亡基因

Fas-L(Fas配基)是調(diào)控細胞凋亡的基因之一,屬于腫瘤壞死因子受體家族[2]，是一種促凋亡蛋白。在缺血腦組織內(nèi)，F(xiàn)as-L表達增多，通過以Fas/Fas-L系統(tǒng)為代表的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將凋亡信號傳遞到細胞內(nèi)，促使細胞凋亡[3]。Fas-L蛋白復(fù)合三聚體具有誘導(dǎo)凋亡的能力，并通過死亡域間的相互作用促進Fas-L蛋白聚合而傳導(dǎo)死亡信號，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，啟動靶細胞內(nèi)的凋亡程序。實驗顯示Fas-L蛋白表達增多時，凋亡明顯可見，干預(yù)治療后Fas-L蛋白表達減少，說明Fas-L與凋亡密切相關(guān)。本研究表明Fas-L蛋白在正常新生大鼠腦內(nèi)弱表達，缺氧缺血后病變部位出現(xiàn)散在分布的強陽性細胞，多是凋亡腦細胞，提示Fas-L與腦細胞凋亡有直接的關(guān)系，F(xiàn)as-L參與了腦細胞凋亡的過程。具體的說，本實驗中大白鼠缺血2 h再灌注2 h后Fas蛋白表達增加，再灌注6 h Fas蛋白表達達高峰，再灌注24 h后表達與6 h相比明顯減弱(P<0.01)，與文獻報道一致，說明腦缺血再灌注后存在Fas介導(dǎo)的細胞凋亡。

3.2 p-PKB蛋白

p-PKB(磷酸化蛋白激酶B)，是一種在很多生物反應(yīng)中起重要作用的絲氨酸蛋白激酶。腦缺血時，PI3-K(3磷脂酰肌醇激酶)/PKB通路激活，可減少細胞的凋亡[4，5]。PKB為分子量大約為60 kD的蛋白激酶，是PI3-K/PKB通路中PI3-K直接的下游作用靶點，該通路激活時PI3-K可以磷酸化PKB蘇氨酸308(Thr-308)和絲氨酸473(Ser-473)位點的氨基酸殘基，從而激活PKB轉(zhuǎn)換成其活化形式(p-PKB),而p-PKB對腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元有保護作用。

3.3 NGF的神經(jīng)保護作用及機制

NGF是神經(jīng)系統(tǒng)重要的生物活性分子之一[6]。它最初是從小鼠的頜下腺提取的,其分子量140000 kD左右,有3個亞單位組成(α、β、γ),廣泛分布于神經(jīng)元的胞體、胞質(zhì)和突起[7]。NGF作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì),有保護神經(jīng)元,對抗缺氧、興奮性氨基酸、自由基和低血糖、細胞內(nèi)鈣超載及一氧化氮損傷的作用[8]。在神經(jīng)損傷后，NGF重新表達，保護受損的神經(jīng)，對神經(jīng)細胞的發(fā)育、成熟、存活都有重要作用，主要可能與以下機制有關(guān)[9]：(1) NGF可提高氧自由基清除劑的活力,增加過氧化氫酶，超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過氧化氫酶的活性，從而減少NO的產(chǎn)生量,抑制fas-L蛋白的表達,對減輕神經(jīng)元損傷有重要作用[10]；(2)NGF影響細胞膜上離子泵,如Na+，K+-ATPase 的活性,穩(wěn)定細胞內(nèi)Na+/K+濃度比,拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性；(3)穩(wěn)定細胞內(nèi)鈣濃度；(4)有實驗證明,NGF可以通過促進Bcl-2、HSP70的表達,抑制c-fos、c-jun、P53蛋白的表達,抑制caspase-3、ERK-1的表達[11-14],從而起到抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。

近年的研究表明，在腦毛細血管內(nèi)皮細胞上富含一些特殊蛋白質(zhì)，可轉(zhuǎn)運一些特殊蛋白質(zhì)分子。而且，血腦屏障本身還存在固有的薄弱環(huán)節(jié)。再者，腦缺血時血腦屏障可能有一定程度的破壞。故本實驗選擇肌肉注射NGF。結(jié)果表明，NGF注射組的大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低，F(xiàn)as-L蛋白表達明顯減少，p-PKB蛋白表達明顯增多，說明肌肉注射NGF有明顯的保護作用。

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