張黎川，王佳瑞，孟 強(qiáng)，李恩成，王 琪

(1.大連大學(xué) 附屬中山醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué) 研究生院，遼寧 大連 116044；3.大連市第五人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，遼寧 大連 116021；4.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116027)

中國(guó)是肺癌的高發(fā)國(guó)家，近十年肺癌的發(fā)病率分別占男性和女性惡性腫瘤的第一和第二位?；熢诜伟┑闹委熤邪l(fā)揮著重要的作用[1]。然而，化療耐藥仍然是導(dǎo)致肺癌化療失敗的主要原因?；煹哪退幮陨婕岸喾N機(jī)制，除了與腫瘤的基因類型有關(guān)外，還與腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境密切相關(guān)[2,3]。在腫瘤組織中，由于血供不足及營(yíng)養(yǎng)條件差等原因，存在低糖、缺氧及酸中毒的微環(huán)境。而這些應(yīng)激條件可誘導(dǎo)一組被稱為糖調(diào)節(jié)蛋白(Glucose Regulated Proteins,GRPs)的應(yīng)激性蛋白質(zhì)合成[4,5]。其中，研究較多的一種是分子量為94 kD的GRP94[6-8]。作為一種分子伴侶，它能夠保護(hù)正常細(xì)胞，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞正常生長(zhǎng)。而在腫瘤細(xì)胞中GRP94的誘導(dǎo)則可能作為潛在的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的因素[9,10]。

研究表明，GRP94在多種腫瘤細(xì)胞包括肺癌中呈高表達(dá)狀態(tài)[11-13]。GRP94的高表達(dá)與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及致瘤性有關(guān)，它可以降低腫瘤細(xì)胞對(duì)X光照射的敏感性[14]。而抑制GRP94的表達(dá)，則能夠提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥足葉乙甙(VP-16)的敏感性[15,16]。但是，目前對(duì)GRP94與肺癌耐藥關(guān)系的研究頗少。本研究旨在用RT-PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)，檢測(cè)在Ca2+拮抗劑A23187誘導(dǎo)下， GRP94在人肺癌細(xì)胞SPCA1中的表達(dá)，并探討其表達(dá)在肺癌細(xì)胞對(duì)VP-16耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

人肺腺癌標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株SPCA-1(購(gòu)自上海生科院細(xì)胞研究所的美國(guó)ATCC細(xì)胞)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma公司)、A23187(北京中山生物公司)、VP-16(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)、多克隆羊抗GRP94抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、異硫氰酸熒光素(美國(guó)Santa Cruz公司)、MTT(Amresco公司)，DMSO(Sigma 公司)。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將SPCA1細(xì)胞在含有10%小牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、含5%CO2的孵箱中無(wú)菌培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取指數(shù)生長(zhǎng)期的SPCA1細(xì)胞，以5×106/mL細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中。細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS液洗2次，待用。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理：將1×106個(gè)細(xì)胞接種于100 mL的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后，倒掉培養(yǎng)液。再將細(xì)胞加入含有不同濃度A23187(0、0.5、1、1.5、2、4、6 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h(A23187濃度為0作為對(duì)照組，其它各處理組為實(shí)驗(yàn)組)。然后采用RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞GRP94在核酸水平的表達(dá)。應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)在A23187濃度為(0、0.5、1、1.5、2、4、6 μmol/L)時(shí)GRP94的蛋白表達(dá)。

1.2.3 RNA提取以及RT-PCR：按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)分別提取各組細(xì)胞的總RNA，取2 μL溶液，應(yīng)用分光光度儀測(cè)RNA濃度及純度。制備cDNA，進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。GRP94mRNA上游引物序列為5′CAGTTTTGGATCTTGCTGT 3′，下游引物序列為5’GTATCCTCTTCACCAGTTGG 3’；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5’TCGTCACCAACTGGGACGACATGG 3’，下游引物序列5′CAGCTGTAGATTCCTTTGC 3′。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用美國(guó)UVP凝膠成像系統(tǒng)EC3 System進(jìn)行掃描分析，計(jì)算公式為：某樣品GRP94 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平=樣品GRP94的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)：將各組細(xì)胞以固定液(冷甲醇∶丙酮=1∶1)固定15 min，然后用0.1%PBST沖洗3次。加入一抗(羊抗人GRP94多克隆抗體)，4℃過(guò)夜。PBS沖洗后，加入二抗(FITC標(biāo)記的兔抗羊抗體)，閉光，室溫下放置1 h后甘油封片。熒光顯微鏡照相觀察熒光出現(xiàn)的位置及強(qiáng)度。

1.2.5 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞在化療藥物作用下的生存：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SPCA1細(xì)胞系的各組細(xì)胞，分別以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和濕度的37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的VP-16至終濃度分別為0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)孔，繼續(xù)培養(yǎng)VP-16組48 h后，再向各孔加入MTT 20 μL，4 h后加入DMSO，酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)490 nm，檢測(cè)各孔IOD值，計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組IOD值-空白對(duì)照組IOD值/(對(duì)照組IOD值-空白對(duì)照組IOD值)×100%。應(yīng)用Modified Kaber method法求出細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度( IC50),并求得耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)(RI)=IC50實(shí)驗(yàn)組/IC50對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 GRP94核酸水平的表達(dá)

不同濃度A23187(0、0.5、1、1.5、2、4、6 μmol/L)誘導(dǎo)后GRP94 mRNA的相對(duì)表達(dá)量如圖1所示。在A23187誘導(dǎo)下，GRP94 mRNA表達(dá)水平逐漸提高，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，即當(dāng)A23187的濃度為0.5～6 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比， GRP94 mRNA分別提高了0.7～4.3倍。

2.2 GRP94蛋白水平的表達(dá)

FITC染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：在488 nm激發(fā)光的激發(fā)下，GRP94主要表達(dá)在細(xì)胞核周?chē)?，呈環(huán)形分布。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(A23187誘導(dǎo))的熒光強(qiáng)度均有明顯增強(qiáng)，且隨A23187濃度提高綠色熒光逐漸增強(qiáng)。即在A23187誘導(dǎo)下GRP94的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，與A23187呈一定的濃度依賴性。當(dāng)A23187濃度6 μmol/L時(shí)，GRP94熒光強(qiáng)度最大。見(jiàn)圖2。

圖1 SPCA1細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，不同濃度A23187處理后各組細(xì)胞GRP94的mRNA表達(dá)水平

圖2 A23187誘導(dǎo)后，SPCA1各組細(xì)胞GRP94蛋白表達(dá)

2.3 細(xì)胞生存率的檢測(cè)

為了研究GRP94的誘導(dǎo)表達(dá)能否對(duì)SPCA1細(xì)胞與VP-16的耐藥性產(chǎn)生影響，本研究比較了不同濃度A23187(0、0.5、1、1.5、2、4、6 μmol/L)誘導(dǎo)下細(xì)胞的生存率。結(jié)果顯示：隨A23187濃度的升高，細(xì)胞的IC50值逐漸升高，各處理組與對(duì)照組IC50值比較差異均有顯著性意義(P<0.05)，除了0.5 μmol/L與1 μmol/L A23187處理組及1 μmol/L與1.5 μmol/LA23187處理組間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)外，A23187濃度為0、1、2、4、6 μmol/L處理組組間IC50差異均有顯著性意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)提示：SPCA1各組細(xì)胞mRNA表達(dá)與相對(duì)應(yīng)VP-16的IC50值之間呈正相關(guān)(r=0.78，P<0.05)。SPCA1細(xì)胞對(duì)VP-16耐藥性增加與GRP94上調(diào)有關(guān)。見(jiàn)圖3。

圖3 A23187誘導(dǎo)后，SPCA1各組細(xì)胞對(duì)VP-16的生存率

3 討 論

無(wú)論是內(nèi)在的因素還是外在的作用條件，均使腫瘤細(xì)胞容易遭受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響[17]。GRP94是一種研究較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白，也是最廣泛的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖基化蛋白，它與熱休克蛋白90(HSP90)有50%的同源性[13]。GRP94具有多種功能，作為與鈣結(jié)合的分子伴侶，它們主要參與蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)。各種應(yīng)激條件如葡萄糖缺乏、蛋白錯(cuò)誤折疊、蛋白糖基化及一些誘導(dǎo)劑(如Ca2+-ATPase抑制劑Thapsigargin)都可以激活GRP94的轉(zhuǎn)錄基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生GRP94[17,18]。研究發(fā)現(xiàn)，GRP94的高表達(dá)是腫瘤進(jìn)展以及預(yù)后不良的標(biāo)志[19]。此外，GRP94在肺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)與腫瘤的分化及進(jìn)展也有關(guān)[12]。作為具有抗凋亡作用的分子伴侶，GRP94與腫瘤的致瘤性及保護(hù)性免疫有關(guān)[20,21]。

本研究表明：A23187可以明顯誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞系SPCA1中GRP94的表達(dá)，于核酸和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均在一定范圍內(nèi)隨誘導(dǎo)劑呈濃度依賴性增高，其原因可能是A23187可以通過(guò)干擾Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、激活GRPs的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的缺失而誘導(dǎo)GRPs的產(chǎn)生[18]。

作者早期報(bào)道了人類肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1在誘導(dǎo)劑A23187作用下GRP94的表達(dá)上調(diào)與該細(xì)胞對(duì)VP-16的耐藥有關(guān)[10]。目前，在人類肺癌中，肺腺癌發(fā)病率有增加趨勢(shì)，尤其在青年男性，各年齡段的女性以及非吸煙者中多見(jiàn)[22]。因此，本研究選擇人肺腺癌細(xì)胞系SPCA1作為研究對(duì)象。Dong等[23]在對(duì)DOX、VP-16以及TAX等藥物耐藥的乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞的GRP94的表達(dá)水平高于非耐藥細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：A23187誘導(dǎo)組的GRP94表達(dá)增高的細(xì)胞對(duì)VP-16的IC50值也明顯高于對(duì)照組。根據(jù)各組細(xì)胞IC50以及GRP94表達(dá)的變化趨勢(shì)，可以推斷：GRP94表達(dá)能夠增加SPCA1細(xì)胞對(duì)VP-16的耐藥性，并且其耐藥性與GRP94表達(dá)的程度有關(guān)。然而，GRP94增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性機(jī)制目前還不十分明確。Pan等[24]發(fā)現(xiàn)抑制GRP94表達(dá)能增加Panc-1 細(xì)胞在放線菌素D作用下的凋亡率。也有研究報(bào)道，GRP94能夠降低SH-SY5Y的死亡率，并且能減少缺血再灌注損傷條件下神經(jīng)細(xì)胞的死亡[25,26]。在另一項(xiàng)研究中，鈣蛋白酶II介導(dǎo)的GRP94的水解能增加胃癌細(xì)胞的凋亡率[27]。在本研究中，GRP94誘導(dǎo)表達(dá)明顯增高的細(xì)胞組的生存率較GRP94表達(dá)低的細(xì)胞組明顯增加，提示具抗凋亡作用的GRP94對(duì)肺癌細(xì)胞也具有保護(hù)作用，可能參與肺癌的耐藥。關(guān)于GRP94表達(dá)與肺癌耐藥的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

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