莊秋紅 李 譞 趙學(xué)忠

(吉林省武警總隊醫(yī)院，吉林 長春 130062)

血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)是構(gòu)成血管壁的重要成分，其增殖和凋亡的失衡可以導(dǎo)致動脈粥樣硬化(AS)和PCI術(shù)后管腔再狹窄。有研究證明鈣通道阻滯劑(CCB)類藥物有抗AS作用。鹽酸地爾硫艸卓(合貝爽)是CCB中地爾硫艸卓類藥物，本實驗應(yīng)用合貝爽抑制血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC增殖，并觀察其對凋亡基因的影響，旨在探討合貝爽有無抗AS作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及分組 清潔級Wistar大鼠在無菌操作條件下取胸主動脈中層加入RPMI1640培養(yǎng)液，采用貼塊法培養(yǎng)，放入CO2孵箱培養(yǎng)，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待單層細(xì)胞生長近培養(yǎng)瓶底80%以上時可傳代。實驗中采用4～6代VSMC。采用兔抗大鼠平滑肌肌動蛋白(α-SMA)對動脈平滑肌細(xì)胞進行肌動蛋白免疫組化染色，鑒定其是否為VSMC。

將 4～6代 VSMC隨機分為空白組、模型組(AngⅡ10－7mol/L)、模型 +合貝爽1組(合貝爽10－5mol/L)、模型 +合貝爽2組(合貝爽10－6mol/L)、模型+合貝爽3組(合貝爽10－7mol/L)，以上各組培養(yǎng)48 h。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖能力測定 采用MTT法檢測VSMC的生長率，各組細(xì)胞加入MTT溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，加入二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度值。

1.2.2 原位細(xì)胞凋亡染色 各組細(xì)胞爬片用40% 多聚甲醛室溫固定30 min，放入0.3%H2O－2甲醇中30 min封閉，放入0.1%TritonX-100枸櫞酸鈉緩沖液中冰浴2 min，加25μl的TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃反應(yīng)60 min，加25μl轉(zhuǎn)化劑，在濕盒中37℃孵育30 min，加入DAB底物溶液，室溫孵育10 ～30 min，復(fù)染核，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.3 RT-PCR 法檢測細(xì)胞內(nèi) Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA 的表達情況

1.2.3.1 各組VSMC中總RNA提取 VSMC中加入1 ml Trizol試劑，輕輕搖動至細(xì)胞裂解、液體變黏，加入0.2 ml氯仿，離心后取上層水相加入0.5 ml異丙醇，室溫下放置10 min后混勻，離心后沉淀中加入75%乙醇1 ml洗滌1次，離心后沉淀干燥10 min，沉淀重懸于DEPC水中。

1.2.3.2 反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù) (1)總RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):等量取上述每個標(biāo)本總RNA 1μg，分別逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系(20 μl):RNA 10 μl、Oligo dT 1 μl，90℃水浴5 min，置于冰上2 min，后續(xù)加 M-MLV 1 μl、dNTP 2 μl、RNase抑制劑0.5 μl、雙蒸水 5.5 μl，42℃水浴 60 min，95℃水浴 5 min，置于 4℃保存。(2)PCR反應(yīng)體系(50μl)10×PCR緩沖液5μl、MgCl25μl、dNTP 1μl、目的基因上游、下游引物各1 μl、Tap DNA 酶1 μl、樣本cDNA 2μl、重蒸水32μl。反應(yīng)條件:95℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸 60 s，循環(huán)30次。

1.2.3.3 電泳分離、結(jié)果測定 取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外分析儀下觀察，并拍照記錄結(jié)果，每份樣品的GAPDH擴增帶均應(yīng)陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 各組數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用樣本均數(shù)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 VSMC的鑒定 采用α-SMA免疫組化染色，結(jié)果顯示＞98%的細(xì)胞染色呈陽性，即細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色反應(yīng)，胞核不著色，表明細(xì)胞含有肌動蛋白，證實為VSMC。見圖1。

2.2 合貝爽對VSMC增殖能力的影響 模型組生長率比空白組明顯升高，兩者存在顯著差異(P＜0.05)，提示AngⅡ促進VSMC增殖;合貝爽1、2、3組生長率均比模型組顯著降低，有顯著差異(P＜0.05)，并與劑量相關(guān)，提示合貝爽有抑制AngⅡ促進的VSMC增殖的作用。見表1。

2.3 合貝爽對VSMC凋亡的影響 TUNEL染色陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色著色，細(xì)胞質(zhì)不著色。在400倍顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞的個數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)即為凋亡率。合貝爽1、2、3組凋亡率比模型組增高，有顯著差異(P＜0.05)，并與劑量相關(guān)，提示合貝爽有促進VSMC凋亡的作用。見表1。

2.4 合貝爽對 VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53基因表達的影響合貝爽1、2、3組Bcl-2 mRNA的表達量比模型組減少，有顯著差異(P＜0.05)，說明合貝爽對Bcl-2的表達有抑制作用。合貝爽1、2、3組Bax、Fas mRNA的表達量比模型組增多，有顯著差異(P＜0.05)，說明合貝爽對Bax、Fas的表達有促進作用。合貝爽1、2組P53 mRNA的表達量比模型組增多，合貝爽3組P53 mRNA的表達量與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，說明合貝爽對P53的表達有促進作用。見表2和圖2。

表1 不同濃度合貝爽對AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖及凋亡率的影響(x ± s，n=8)

表2 各組VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA的表達情況(x ± s，n=3)

圖1 VSMCα-SMA免疫組化染色(×200)

圖2 各組 VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA 的表達

3 討論

VSMC是構(gòu)成血管壁的重要成分，其過度增殖、凋亡減少是動脈粥樣硬化(AS)和PCI術(shù)后管腔再狹窄形成的重要步驟〔1〕。因此開發(fā)安全有效的促進VSMC凋亡、抑制增殖的藥物具有重要臨床意義。合貝爽(herbesser)通用名為地爾硫艸卓，主要作用為抑制平滑肌細(xì)胞收縮，擴張冠狀動脈，用于治療不穩(wěn)定型心絞痛。本實驗結(jié)果顯示合貝爽能使VSMC生長率降低，凋亡率增加，說明合貝爽可能有抑制VSMC的增殖、促進VSMC凋亡的作用。

本實驗顯示合貝爽抑制抗凋亡Bcl-2的表達，促進促凋亡基因Bax、Fas、P53的表達。Bcl-2是抗凋亡基因，通過阻止線粒體膜上通透性孔道的開放，阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放，抑制caspase-9的激活;中和促進凋亡的蛋白和引起細(xì)胞核谷胱苷肽(GSH)積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低caspase的活性，最終抑制 VSMC 的凋亡〔2〕。Bax、Fas、P53 是促凋亡基因，通過激活線粒體途徑和死亡受體途徑，最終導(dǎo)致VSMC凋亡的發(fā)生。Bax在細(xì)胞內(nèi)超表達，形成同源二聚體多，Bax與Bcl-2形成異源二聚體減少，與Bax分離的Bcl-2增多，使Bcl-2失去了抗凋亡能力，細(xì)胞對死亡信號的反應(yīng)增強〔3〕。P53是Bax的正調(diào)因子、Bcl-2的負(fù)調(diào)因子，Bcl-2/Bax的減少使細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來，近而導(dǎo)致快速的caspase級聯(lián)反應(yīng)，最后導(dǎo)致線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔4〕。P53還可以改變死亡受體的分布，使其由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，增加細(xì)胞對死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性〔5〕。Fas是死亡受體家族的重要成員，F(xiàn)as與Fas配體蛋白在細(xì)胞膜上結(jié)合后，觸發(fā)自身三聚化，激活caspase-3，caspase-3水解多種蛋白如內(nèi)源性DNA酶、細(xì)胞骨架成分，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡〔6〕。

綜上所述，合貝爽可能通過抑制抗凋亡基因Bcl-2表達，促進促凋亡基因Bax、Fas和P53表達，使VSMC凋亡增加，抑制VSMC增殖。VSMC增殖減少使血管壁細(xì)胞數(shù)量減少、內(nèi)膜變薄、管腔狹窄減輕，減少了細(xì)胞因子的釋放和基質(zhì)降解酶和促血栓分子的表達，延緩或逆轉(zhuǎn)了AS的發(fā)展〔7〕。VSMC增殖的減少延緩了其向內(nèi)膜下遷移，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的合成，防治了PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生〔8〕。

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