張雪玲 齊曉嵐 單可人 官志忠

(貴陽醫(yī)學院分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆，是一種主要在老年期發(fā)生的以認知能力緩慢性進行性喪失為主要特征的神經退變性疾病。病理學上以細胞外老年斑(SPs)形成及神經細胞內神經原纖維纏結(NFTs)為主要特征〔1～3〕。SPs的主要成分為β-淀粉樣蛋白(Aβ)，是一種神經毒性物質，可以引起神經元的損傷和死亡，在 AD的發(fā)病中起著重要的作用。β-分泌酶(BACE)是啟動Aβ形成的關鍵限速酶。因此，BACE有望成為治療AD的作用靶點，為開發(fā)治療AD的提供了一條新思路〔4〕。神經型尼古丁受體(nAChR)與大腦學習記憶、智力發(fā)育和識別能力等腦功能有關，還具有明顯的神經保護作用〔5〕，在AD的發(fā)病中起著重要的作用。本課題組前期研究表明α3 nAChR具有一定的對抗Aβ的神經毒性作用，在AD的發(fā)病機制中具有重要作用〔6〕，但其具體機制是否與Aβ生成密切相關的BACE有關，有待進一步研究。本研究觀察α3 nAChR是否通過影響B(tài)ACE蛋白表達從而減少Aβ的神經毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備 D-MEM培養(yǎng)液購自Gibco Invitrogen公司(英國);G418購自Sigma公司;普通化學試劑均購自Sigma公司;源于人腦的神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y細胞)購于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司(德國);穩(wěn)定轉染α3 nAChR siRNA表達質粒及空質粒的SH-SY5Y神經細胞本課題組于2008年凍存于本實驗室液氮罐中;羊抗BACE1及BACE2、鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗羊及抗鼠二抗購自Santa Cruz公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SH-SY5Y細胞為貼壁細胞。用含15%小牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的DMEM作為培養(yǎng)基，轉染 α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo質粒的實驗組與轉染空質粒Negative control pSilencer 3.1-H1 neo的空質粒對照組，還需用含 0.4 mg/ml G418的培養(yǎng)液篩選，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 SH-SY5Y細胞α3 nAChR基因沉默效果測定 采用Trizol(Invitrogen)一步法提取細胞總RNA。將mRNA逆轉錄反應成cDNA。以逆轉錄產物為模板進行Real-time PCR。所用試劑為 TaqMan Universal 2 ×PCR Mix，α3 nAChR(Hs01088199_m1)和內對照β-actin(4352935E)Taqman探針購自Applied Biosystems公司，ABI7300型熒光定量PCR儀采集待測基因及內參照 β-actin擴增各循環(huán)熒光信號，以 Applied Biosystems SDS1.4軟件進行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。SDS1.4軟件分析其△△Ct值及 RQ(relative quantity)值，RQ=2-△△Ct。分析實驗結果時以β-actin為內對照，計算轉染α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo質粒的實驗組與正常對照組及空質粒對照組間α3 nAChR mRNA和對照組的相對水平。用蛋白印跡方法檢測α3 nAChR蛋白表達水平。重復三次。

1.2.3 BACE蛋白表達水平測定 參照Guan等〔7〕的方法進行提取細胞蛋白并定量，加磷酸鹽緩沖液(PBS，4℃預冷)洗滌一次后用細胞刮收集細胞入1.5 ml無菌離心管中，再用PBS洗滌一次加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)和復合蛋白酶抑制劑的細胞裂解液約40～60μl，置于冰上1 h，其間不時置于漩渦混勻器，使細胞充分裂解;12 000 r/min，4℃，離心40 min;小心吸取上清液至另一發(fā)泡聚丙烯(EPP)管;對上述制備的上清液進行蛋白定量后分裝，－20℃保存?zhèn)溆?用蛋白印跡方法檢測BACE1，BACE2蛋白表達水平。實驗重復三次。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用 SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行分析，所得結果用x±s表示，兩因素析采用方差分析。

2 結果

2.1 穩(wěn)定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株mRNA及蛋白表達水平 用Real-time RT-PCR及Western印跡方法檢測到SH-SY5Y細胞轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒后mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P＜0.01)，而轉染空質粒與正常對照組相比差異無顯著性。見表1，圖1。

圖1 穩(wěn)定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株α3 nAChR蛋白表達

2.2 α3 nAChR基因表達沉默對SH-SY5Y細胞BACE蛋白表達水平的影響 SH-SY5Y細胞α3 nAChR基因表達沉默后，細胞BACE 1蛋白表達水平明顯增高(P＜0.01)，BACE 2蛋白表達水平明顯下降(P＜0.01)。見表2，圖2。

圖2 穩(wěn)定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株BACE1及BACE2蛋白表達

表1 穩(wěn)定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株α3 nAChR mRNA及蛋白表達(x ± s，n=3)

表2 穩(wěn)定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株BACE1、BACE2蛋白表達水平(x ± s，n=3)

3 討論

nAChR是一類明確的具有神經保護功能的受體，與大腦學習記憶、智力發(fā)育和識別能力等腦功能有關，還調節(jié)多種受體的功能，并具有對抗細胞毒性神經保護作用，其含量減少與AD的發(fā)生有關，在SH-SY5Y神經細胞中α3是主要的尼古丁受體亞類之一，與AD的發(fā)病有關。但α3 nAChR對與Aβ生成密切相關的BACE的蛋白表達的影響尚未見報道。Aβ是由其APP經β-和γ-分泌酶水解后而形成，具有一定的神經毒性作用，可以引起神經元的損傷和死亡，只有完整的Aβ才能發(fā)揮神經毒性作用。BACE是啟動Aβ形成的關鍵限速酶，有兩個亞型即BACE1和BACE2。BACE1是具有BACE活性的天門冬氨酸蛋白酶，俗稱BACE1或BACE。研究表明純化的BACE1蛋白的確在BACE的作用位點進行切割〔8〕，從而增加神經毒性物質Aβ的生成。在發(fā)現(xiàn) BACE1不久，發(fā)現(xiàn)了其同源蛋白稱為BACE2。研究表明，BACE2雖能在BACE位點裂解APP，但它在Aβ結構域內部的裂解更有效，因此BACE2可抑制神經毒性物質的Aβ生成〔9〕。本課題組前期研究顯示α3 nAChR具有一定對抗Aβ的神經毒性作用，其是否與β分泌酶有關未見報道。本課題組構建了SH-SY5Y細胞α3 nAChR siRNA真核表達載體，并且有效地表達了針對α3 nAChR的siRNA，將其轉染至SH-SY5Y細胞，采用實時熒光定量(RT-PCR)和蛋白印跡方法分別對α3尼古丁受體基因mRNA和蛋白水平進行了分析。結果表明，由siRNA介導沉默后α3尼古丁受體基因的表達及蛋白的表達均明顯下降，且下降程度基本一致。結果表明小分子干擾RNA能有效地抑制內源性α3 nAChR基因的表達。本研究結果顯示穩(wěn)定轉染α3 nAChR siRNA表達質粒的細胞克隆株，與空質粒及正常對照組相比BACE1蛋白表達水平增加，BACE2蛋白表達水平減少，表明α3 nAChR能夠增加BACE2蛋白表達水平及減少BACE1蛋白表達水平而影響Aβ的生成從而對抗Aβ的神經毒性作用，發(fā)揮神經保護作用。

1 Nordberg A.Nicotinic receptor abnormalities of Alzheimer's disease:therapeutic implications〔J〕.Biol Psychiatry，2001;49(3):200-10.

2 Doody RS，Stevens JC，Beck C.Practice parameter:management of demen-tia(an evidence-based review)〔J〕.Neurology，2001;56(9):1154-66.

3 Paterson D，Nordberg A.Neuronal nicotinic receptors in the human brain〔J〕.Prog Neurobiol，2000;61(1):75-111.

4 Hong L，Turner RT，Koelsch G，et al.Memapsin 2(beta-secretase)as a therapeutic targe〔tJ〕.Biochem Soc Trans，2002;30(4):530-4.

5 Kihara T，Shiohama S，Sawasa H，et al.Nicotinic receptor stimulation protects neurons against β-amyloid toxity〔J〕.Ann Neurol，1997;42(2):159-63.

6 唐 智，齊曉嵐，單可人，等.SH-SY5Y神經細胞中尼古丁受體α3亞單位基因表達抑制與APP代謝的關系〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(21):2749-51.

7 Guan ZZ，Miao H，Tian JY，et al.Suppressed expression of nicotinic acetylcholine receptors by nanomolar beta-amyloid peptides in PC12 cells〔J〕.J Neural Transm，2001;108(12):1417-33.

8 Vassar R，Bennett BD，Babu-Khan S，et al.Beta-secretase cleavage of Alzheimers amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE〔J〕.Science，1999;286(5440):735-41.

9 Vassar R，Citron M.Aβ-generating enzymes:recent advances inβ-andγsecretase research〔J〕.Neuron，2000;27(3):419-22.