王 微，吳曉東，時全星，樊 榮，裴建明

(第四軍醫(yī)大學(xué)1.口腔醫(yī)學(xué)系、2.基礎(chǔ)部生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

缺血性心律失常的發(fā)病機(jī)制尚未得到徹底闡明。已有研究證明致命性的室速或室顫都與心室肌細(xì)胞間縫隙連接(Gap junction，GJ)的主要構(gòu)成蛋白Connexin43(Cx43)在結(jié)構(gòu)與功能上的重塑有關(guān)［1］。作為一個鈣相關(guān)的功能蛋白［2］，Cx43 的重塑與細(xì)胞內(nèi)鈣在心肌缺血時發(fā)生的瞬間變化密切相關(guān)［3］。近年來阿片受體及其激動劑對缺血心肌的保護(hù)作用正成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，與心血管功能調(diào)節(jié)有關(guān)的阿片受體分為μ、δ、κ 3種亞型，其中以κ阿片受體分布占主導(dǎo)［4］。我們以往對κ阿片受體的研究顯示，選擇性受體激動劑U50，488H激動κ阿片受體后，可通過抑制交感遞質(zhì)的釋放、抑制β受體的作用、抑制L型鈣通道、以及影響心室肌Cx43的重塑等途徑來抑制缺血性心律失常的發(fā)生［5－10］。本研究通過在大鼠心肌缺血模型中先后給予鈣通道激動劑(Bay k8644)和U50，488H，觀察κ阿片受體的抗心律失常作用及對抗Cx43重塑的調(diào)節(jié)作用是否被翻轉(zhuǎn)，來判斷U50，488H是否通過抑制鈣通道減少外鈣內(nèi)流參與了κ阿片受體的抗缺血性心律失常作用。

1 材料與方法

1.1材料健康♂SD大鼠30只，體質(zhì)量250～350 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。微型動物呼吸機(jī)由第二軍醫(yī)大學(xué)儀器廠生產(chǎn)。RM－6280智能多道生理記錄儀及分析處理軟件由第四軍醫(yī)大學(xué)設(shè)計，成都儀器廠生產(chǎn)。Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀及其所配置的Quantity One軟件由加拿大Bio-Rad公司設(shè)計和生產(chǎn)。U50，488H及Bay k8644均購自Tocris公司，Western blot所用小鼠抗Cx43抗體購自Abcam公司(ab11369)，小鼠抗Tubulin抗體購自上海碧云天公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠抗體購自北京ZSGB-BIO公司，RT-PCR所用TRIzol試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.2急性心肌缺血動物模型的建立用30 g·L－1戊巴比妥鈉麻醉大鼠(1.5 ml·kg－1，ip)，常規(guī)記錄肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，并輸入多道生理記錄儀進(jìn)行全程同步連續(xù)記錄。分離左側(cè)股靜脈，建立給藥途徑。氣管插管，微型動物呼吸機(jī)給予正壓人工呼吸。而后于大鼠胸骨左緣第4-5肋間開胸，暴露心臟，剪開心包膜，在冠狀動脈左前降支(LAD)距左心耳下緣約2 mm處穿線(6/0絲線)，以備結(jié)扎，再用直徑約0.2 cm細(xì)塑料管穿過結(jié)扎線，穩(wěn)定15 min后進(jìn)行心肌缺血，即用止血鉗夾緊結(jié)扎線。以心電圖ST段明顯抬高，結(jié)扎線以下心肌顏色改變?yōu)樾募∪毖獦?biāo)志。缺血30 min后取大鼠左心室前壁缺血區(qū)心肌組織為樣本。

1.3動物模型試驗(yàn)分組將所有大鼠編號，隨機(jī)分成以下5組:① 對照組(Sham)，僅穿線而未結(jié)扎LAD，觀察時間過后直接取材。②缺血組(Isc)，結(jié)扎LAD，給予心肌缺血30 min后取材。③缺血+U50，488H組(Isc+U50)，結(jié)扎LAD前10 min經(jīng)股靜脈給予 U50，488H(1.5 ml·kg－1)，余同②。④缺血 +U50，488H+Bay k8644 組(Isc+U50+Bay)，結(jié)扎LAD前15 min經(jīng)股靜脈給予鈣通道激動劑Bay k8644(66.7 μg·kg－1)，余同 ③。⑤缺血 +Bay 組(Isc+Bay)，結(jié)扎LAD前15 min經(jīng)股靜脈給予Bay k8644(66.7 μg·kg－1)，給予心肌缺血 30 min 后取材。

1.4心律失常評分標(biāo)準(zhǔn)采用Curtis和Walker建立的心律失常評分標(biāo)準(zhǔn)［11］并予以改良，把心肌缺血的總過程分為平均時長為3 min的10個段，分別記錄每3 min內(nèi)的心律失常發(fā)生情況，具體評分細(xì)則如下:0=每3 min內(nèi)出現(xiàn)小于10個室性早搏;1=每3 min內(nèi)出現(xiàn)10到50個室性早搏;2=每3 min出現(xiàn)大于等于50個室性早搏;3=每3 min內(nèi)出現(xiàn)1段室顫;4=每3 min內(nèi)出現(xiàn)2到5段室顫;5=每3 min內(nèi)出現(xiàn)大于5段室顫。最后，由各組中各時段的評分累加，綜合分析得出結(jié)果。

1.5Cx43蛋白表達(dá)觀察將心肌組織溶解于含有1 mmol·L－1蛋白酶抑制劑(antipain)，聯(lián)苯胺(benzamidine)，亮抑蛋白酶肽(leupeptin)，胃蛋白酶抑制劑(pepstatin A)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，質(zhì)量濃度為0.1的十二烷硫酸鈉(SDS)，以及5 mmol·L－1乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS緩沖液提取出總蛋白，采用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，依次加用小鼠抗Cx43多克隆抗體(內(nèi)參為小鼠抗Tubulin抗體)及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體進(jìn)行孵育，運(yùn)用Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀顯色曝光，并應(yīng)用配套軟件Quantity One記錄和分析結(jié)果。

1.6Cx43mRNA表達(dá)觀察用TRIzol試劑提取出心肌組織中的總RNA，依照Cx43——5'-GCG GCTTGCTGAGAACC-3'，5'-TTGCGGCACGAGGAATT-3';HPRT(內(nèi)參)——5'-CTCATGGACTGATTATGGACA GGACTG-3'，5'-CAGCGCTTTAATGTAATCCAGCAGGTC-3'的序列設(shè)計引物并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，依照Cx43——94℃ 5 min，(94℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72℃60 s)進(jìn)行 28 次循環(huán)，72℃ 10 min;HPRT—— 95℃3 min(95℃ 90 s，60℃ 120 s)進(jìn)行 30 次循環(huán)，60℃10 min的條件進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增。采用質(zhì)量濃度為0.015的瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA電泳，運(yùn)用Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀曝光，并應(yīng)用配套軟件Quantity One記錄和分析結(jié)果。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Bay k8644對U50，488H介導(dǎo)的抗缺血性心律失常作用的影響心肌缺血后，心律失常評分明顯上升，提示缺血誘發(fā)心律失常。若在缺血前給予κ阿片受體激動劑U50，488H，心律失常評分明顯下降(P＜0.05)，提示U50，488H具有抗缺血性心律失常作用。當(dāng)缺血前先給予鈣通道激動劑Bay k8644再給予U50，488H時，U50，488H的抗心律失常作用即被翻轉(zhuǎn)(P＜0.05)。而單獨(dú)給予 Bay k8644對缺血心肌的心律失常評分沒有影響(Fig 1)。

Fig 1 Effect of Bay k8644 on the anti-arrhythmic effect mediated by U50，488H(±s，n=6)

2.2Bay k8644對U50，488H調(diào)節(jié)Cx43蛋白表達(dá)的影響心肌缺血時大鼠心室Cx43蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.01)。若在缺血前給予U50，488H，大鼠心室肌Cx43蛋白表達(dá)明顯恢復(fù)(P＜0.01)，提示U50，488H對缺血心肌Cx43具有保護(hù)性上調(diào)作用。若先給予鈣通道激動劑 Bay k8644再給予U50，488H，κ阿片受體激動劑對Cx43的上述保護(hù)性調(diào)節(jié)作用即被阻斷(P＜0.01)。而缺血前單獨(dú)給予Bay k8644降低了缺血心肌Cx43蛋白表達(dá)，但與缺血組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 2)。

Fig 2 Effect of Bay k8644 on the regulation of Cx43 protein expression mediated by U50，488H(±s，n=6)

2.3Bay k8644對U50，488H調(diào)節(jié)Cx43 mRNA表達(dá)的影響心肌缺血時大鼠心室Cx43 mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.01)。若在缺血前給予U50，488H，大鼠心室肌Cx43 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。當(dāng)缺血前先給予鈣通道激動劑Bay k8644再給予U50，488H，κ阿片受體激動劑對Cx43 mRNA的這種調(diào)控作用即被翻轉(zhuǎn)(P＜0.01)。缺血前單獨(dú)給予Bay k8644對缺血心肌Cx43 mRNA表達(dá)并無影響(Fig 3)。

3 討論

當(dāng)心肌發(fā)生缺血時，交感神經(jīng)興奮導(dǎo)致遞質(zhì)釋放增加，通過心肌細(xì)胞β腎上腺素受體(β受體/Gs蛋白/腺苷酸環(huán)化酶/cAMP/蛋白激酶PKA/Ca2+)的信號傳導(dǎo)通路，細(xì)胞內(nèi)鈣發(fā)生瞬時變化，出現(xiàn)鈣超載［12］、鈣振蕩［13］等與心律失常的發(fā)生密切相關(guān)的現(xiàn)象。我們前期關(guān)于κ阿片受體對這條信號通路影響的研究工作也表明，心肌缺血時以U50，488H激動κ阿片受體后，可抑制交感遞質(zhì)的釋放及β受體的作用［6，8］，亦可直接抑制 L 型鈣通道降低心肌細(xì)胞的鈣瞬變和收縮力［7］，從而發(fā)揮抗心律失常作用。本研究整體動物水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鈣通道激動劑Bay k8644能夠翻轉(zhuǎn)U50，488H的抗缺血性心律失常作用(P＜0.05)，說明在導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載的這條通路上，U50，488H通過抑制鈣通道開放，減少外鈣內(nèi)流，從引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高的源頭上阻斷了鈣超載等現(xiàn)象的發(fā)生，從而發(fā)揮它的抗缺血性心律失常作用。

Fig 3 Effect of Bay k8644 on the regulation of Cx43 mRNA expression mediated by U50，488H(±s，n=6)

減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載的措施亦可抑制Cx43的重塑(Cx43基因表達(dá)的變化、數(shù)量改變以及磷酸化水平的改變)及其后發(fā)生的GJ間脫偶聯(lián)的過程［1］，這一過程可導(dǎo)致折返性電活動的發(fā)生，最終引起嚴(yán)重的室性心律失常［14］。Cinca 等［15］的工作表明，缺血預(yù)處理在減小梗死面積的同時，還可以抑制GJ的脫偶聯(lián)和遲發(fā)時相室顫的發(fā)生，這與預(yù)處理使兒茶酚胺釋放減少而降低細(xì)胞內(nèi)鈣，從而抑制了缺血引起的Cx43去磷酸化和細(xì)胞內(nèi)重新分布及GJ的脫偶聯(lián)過程有關(guān)。還有研究表明［16］，直接激活外周迷走神經(jīng)可通過保護(hù)Cx43的功能而抗缺血性心律失常，其中間的重要機(jī)制就是興奮迷走神經(jīng)可降低細(xì)胞內(nèi)鈣的水平。

在本研究中，U50，488H對心肌細(xì)胞Cx43在蛋白和基因表達(dá)水平的保護(hù)性調(diào)節(jié)作用均為鈣通道激動劑Bay k8644所翻轉(zhuǎn)，再次驗(yàn)證了U50，488H是通過減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載來對Cx43進(jìn)行穩(wěn)定性調(diào)控從而發(fā)揮抗心律失常作用的，Bay k8644的翻轉(zhuǎn)作用正說明U50，488H對細(xì)胞內(nèi)鈣升高的減輕來源于對鈣通道的抑制和對外鈣內(nèi)流的阻斷。尤其值得說明的是，在缺血組及缺血+U50，488H組中，我們觀察到了U50，488H對抗缺血心肌Cx43異常下降的蛋白表達(dá)和異常升高的mRNA表達(dá)的作用，這與我們先前研究的發(fā)現(xiàn)一致［9］，被認(rèn)為是 U50，488H 平衡了心肌細(xì)胞在急性缺血狀態(tài)下過度的自我保護(hù)機(jī)制與代償機(jī)制兩種效應(yīng)之后達(dá)到的穩(wěn)定性效果。

目前臨床上常用的鈣通道阻滯劑藥物，機(jī)制多為直接作用于心肌細(xì)胞的鈣通道抑制外鈣內(nèi)流，通過抑制興奮—收縮偶聯(lián)減少心肌ATP消耗，延長房室結(jié)不應(yīng)期以及減慢心室率等效應(yīng)實(shí)現(xiàn)對缺血心肌的保護(hù)及抗心律失常作用［17］。與κ阿片受體激動劑相比，未見關(guān)于其對缺血性心律失常發(fā)生的關(guān)鍵因素—心肌細(xì)胞Cx43蛋白有調(diào)節(jié)作用的報道，并且它也不具備κ-阿片受體激動劑使用后對缺血性損傷事件的預(yù)防性效果。

綜上，本研究初步證明了U50，488H可能通過抑制鈣通道減少外鈣內(nèi)流，參與κ阿片受體對缺血心肌Cx43的穩(wěn)定性調(diào)控及抗缺血性心律失常作用。而在鈣通道之后，κ阿片受體如何具體調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化從而影響Cx43表達(dá)的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

［1］Cabo C，Yao J，Boyden P A，et al.Heterogeneous gap junction remodeling in reentrant circuits in the epicardial border zone of the healing canine infarct［J］.Cardiovasc Res，2006，72(2):241 －9.

［2］Thimm J，Mechler A，Lin H，et al.Calcium-dependent open/closed conformations and interfacial energy maps of reconstituted hemichannels［J］.J Biol Chem，2005，280(11):10646 －54.

［3］Oyamada M，Tsujii E，Tanaka H，et al.Abnormalities in gap junctions and Ca2+dynamics in cardiomyocytes at the border zone of myocardial infarcts［J］.Cell Commun Adhes，2001，8(4-6):335－8.

［4］Tai K K，Jin W Q，Chan T K，Wong T M.Characterization of［3H?-U69593 binding sites in the rat heart by receptor binding studies［J］.J Mol Cell Cardiol，1991，23(11):1297 －302.

［5］張 鵬，朱運(yùn)龍，王躍民，等.κ阿片受體激動劑U50488H對大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常的影響及作用機(jī)制［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2006，11(3):251－5.

［5］Zhang P，Zhu Y L，Wang Y M，et al.Effects and mechanisms of U50488H on ventricular arrhythmias induced by myocardial ische-mia and reperfusion in rats［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2006，11(3):251－5.

［6］Shan D，Wang H，Su Y，et al.Kappa-opioid receptor stimulation inhibits cardiac hypertrophy induced by beta1-adrenoceptor stimulation in the rat［J］.Eur J Pharmacol，2007，555(2-3):100 －5.

［7］畢 輝，郭海濤，朱妙章，等.U50，488H對正常及缺氧心肌細(xì)胞L型鈣電流的作用［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2004，29(8):700－2.

［7］Bi H，Guo H T，Zhu M Z，et al.Effects of U50，488H on L-type calcium current in the normal and hypoxic rat ventricular myocytes［J］.Med J Chin PLA，2004，29(8):700－2.

［8］王偉光，張權(quán)宇，曹鈺琨，等.κ阿片受體可通過抑制β腎上腺素受體進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Cx43發(fā)揮抗缺血再灌注性心律失常［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(4):471－6.

［8］Wang W G，Zhang Q Y，Cao Y K，et al.Antiarrhythmic effect of κ-opioid on Cx43 in rat heart during mycardial ischemia and reperfusion via inhibiting β-adrenergic receptor pathway［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):471 －6.

［9］Zhang Q Y，Wang W，Shi Q X，et al.Antiarrhythmic effect mediated by κ-opioid receptor is associated with Cx43 stabilization［J］.Crit Care Med，2010，38(12):2365－76.

［10］李 娟，郭海濤，畢 輝，等.U50，488H抗大鼠缺血/再灌注損傷心律失常作用與抑制鈉通道電流有關(guān)［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(3):331－6.

［10］Li J，Guo H T，Bi H，et al.Anti-arrhythmic effects of U50，488H involving the inhibition of Na+current in ischemia/reperfusion rat heart［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(3):331 － 6.

［11］Curtis M，Walker M.Quantification of arrhythmias using scoring systems:An examination of seven scores in anin vivomodel of regional myocardial ischemia［J］.Cardiovasc Res，1988，22(9):656－65.

［12］Pei J M，Yu X C，F(xiàn)ung M L，et al.Impaired G(s)alpha and adenylyl cyclase cause beta-adrenoceptor desensitization in chronically hypoxic rat hearts［J］.Am J Physiol(Cell Physiol)，2000，279(5):C1455－63.

［13］Livshitz L M，Rudy Y.Regulation of Ca2+and electrical alternans in cardiac myocytes:Role of CaMKII and repolarizing currents［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(6):H2854 －66.

［14］De Groot J R，Coronel R.Acute ishcemia-induced gap junctional uncoupling and arrhythmogenesis［J］.Cardiovasc Res，2004，62(2):323－34.

［15］Cinca J，Warren M，Carreno A，et al.Changes in myocardial electrical impedance induced by coronary artery occlusion in pigs with and without preconditioning:correlation with local ST segment potential and ventricular arrhythmias［J］.Circulation，1997，96(9):3079－86.

［16］Ando M，Katare R G，Kakinuma Y，et al.Efferent vagal nerve stimulation protects heart against ischemia-induced arrhythmias by preserving connexin43 protein［J］.Circulation，2005，112(2):164－70.

［17］張 捷.鈣通道阻滯劑在心血管疾病中的應(yīng)用［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2(1):60－1.

［17］Zhang J.Application of calcium channel blocker in cardiovascular diseases［J］.Chin J Mod Drug App，2008，2(1):60 －1