張泓波，高維娟，錢 濤，唐敬龍，李 君

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050026;3.河北省人民醫(yī)院，河北石家莊 050051)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由于各種腦血管病引起的獲得性認(rèn)知功能障礙，以學(xué)習(xí)、記憶功能缺損為主要癥狀。目前，VD的發(fā)病呈迅速增長(zhǎng)趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。從中醫(yī)角度來(lái)看，VD的病機(jī)為氣虛血瘀。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是益氣活血中藥的經(jīng)典方劑，目前在臨床上主要治療氣虛血淤所致的中風(fēng)［1］。學(xué)習(xí)和記憶是腦的高級(jí)功能之一，其中樞位于海馬。核轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)是學(xué)習(xí)和記憶形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［2］，磷酸化后的CREB可增強(qiáng)多種靶基因如即早基因(immediate-early genes，IEGs)的表達(dá)，從而使獲得的信息得以長(zhǎng)期儲(chǔ)存。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBP)是一類與DNA增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是IEGs的產(chǎn)物，在新記憶的永久化過(guò)程中具有促進(jìn)作用［3］。本研究通過(guò)觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)VD大鼠海馬組織CREB、C/EBP DNA結(jié)合活性的影響，探討血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治VD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康成年SPF級(jí)SD♂大鼠96只，鼠齡5～6個(gè)月，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2007-0001。購(gòu)買后，飼養(yǎng)于自然光線下，保持溫度20～25℃，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2藥物補(bǔ)陽(yáng)還五湯購(gòu)自承德北京同仁堂藥店分店:補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方(黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍 4.5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g)水煎2次，煎液合并濃縮后使藥液濃度為含生藥6 250 g·L－1。尼莫地平為天津華津制藥廠生產(chǎn)(批號(hào):080317)，溶于雙蒸水制成2.5 g·L－1的混懸液。高壓滅菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前混勻?/p>

1.1.3主要試劑和儀器CREB及C/EBP寡聚核苷酸探針由上海英俊生物工程有限公司合成;核蛋白抽提試劑盒由美國(guó)Pierce公司提供;EMSA試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司;帶正電荷的尼龍膜為美國(guó)Pall公司產(chǎn)品;戊巴比妥鈉購(gòu)自德國(guó)。

Morris水迷宮(LW-Ⅱ型)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所提供;DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和24A型垂直板電泳裝置均由北京六一儀器廠生產(chǎn);Quantity one凝膠分析系統(tǒng)由美國(guó)BIO-RAD公司提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與造模用水迷宮將大鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，篩選出空間學(xué)習(xí)和記憶水平相當(dāng)?shù)拇笫?，按體質(zhì)量差異隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham operation)、模型組(VD model)、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組(BYHWT treatment)和尼莫地平組(Nimodipine treatment)，每組24只。

VD模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、尼莫地平組采用改良的Pulsinelli's四血管阻斷(four-vessel occlusion，4-VO)方法［4］制備VD大鼠模型:用戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1)行腹腔麻醉。將大鼠行背側(cè)頸正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。24 h后再將大鼠麻醉，行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min，共3次，每次間隔1 h。假手術(shù)組:只做皮膚切口和組織分離處理，不進(jìn)行椎動(dòng)脈燒灼和頸總動(dòng)脈夾閉。

1.2.2給藥方法各組大鼠術(shù)后當(dāng)天清醒開始灌胃給藥。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組:給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯50 g·kg－1·d－1;尼莫地平組:給予尼莫地平 20 mg·kg－1·d－1;模型組和假手術(shù)組均給予生理鹽水8 ml·kg－1·d－1。各組連續(xù)給藥 30 d。

1.2.3水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力各組給藥d 25～30，對(duì)大鼠進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)。去除手術(shù)死亡及給藥不耐受者，每組大鼠各22只為最終統(tǒng)計(jì)對(duì)象。以給藥d 29大鼠逃避潛伏期(將大鼠從入水點(diǎn)面向池壁置入水槽中，記錄90 s內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間)的平均成績(jī)作為學(xué)習(xí)成績(jī);給藥d 30大鼠空間探索次數(shù)(撤去平臺(tái)，將大鼠從第二象限入水點(diǎn)放入水槽，記錄60 s內(nèi)其經(jīng)過(guò)平臺(tái)象限的次數(shù))的平均成績(jī)作為記憶成績(jī)。逃避潛伏期越短、跨越臺(tái)次數(shù)越多，學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。

1.2.4電泳遷移率改變分析法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)測(cè)定CREB、C/EBP的DNA結(jié)合活性水迷宮試驗(yàn)后將各組大鼠迅速斷頭處死，在低溫修塊臺(tái)上分離出雙側(cè)海馬組織。稱重剪碎，勻漿棄上清。按核蛋白提取試劑盒提供的操作規(guī)程提取核蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白定量后－80℃保存。設(shè)計(jì) CREB DNA結(jié)合序列 :5'-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGAGCTAG-3';C/EBP DNA結(jié)合序列5'-GATCAAGCTGCAGATTGCGCAAT-3'。探針標(biāo)記參照DIG Gel Shift Kit操作手冊(cè)進(jìn)行。標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后調(diào)整探針濃度為15.5 pmol·L－1。取各樣本核蛋白4 μg與標(biāo)記的寡核苷酸探針2 μl 25℃孵育15min。采用6%非變性聚丙烯酰凝膠4℃ 80V電泳分離DNA－核蛋白結(jié)合體。電泳完畢將DNA－核蛋白結(jié)合體轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)特異性條帶。經(jīng)曝光、顯影和定影后將圖像掃描至電腦，用Quantity one 4.4凝膠分析軟件對(duì)特異結(jié)合條帶凈灰度值進(jìn)行采集。凈灰度值代表轉(zhuǎn)錄因子與特定DNA的結(jié)合強(qiáng)度和活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。組間比較采用多樣本均數(shù)的One-way ANOVA檢驗(yàn)。兩組均數(shù)比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與假手術(shù)組術(shù)比較，模型組逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.05);與模型組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和尼莫地平組逃避潛伏期均明顯縮短(P＜0.05);跨越平臺(tái)次數(shù)均明顯增多(P＜0.05)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和尼莫地平組之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Comparision of rats'learning and memorizing ability in morris water maze test among four groups(±s，n=22)

Tab 1 Comparision of rats'learning and memorizing ability in morris water maze test among four groups(±s，n=22)

*P＜0.05 vs sham-operation group;#P＜0.05 vs VD model group.

*Nimodipine-treated 20 mg·kg－1·d－126.6 ±1.3# 7.3 ±0.9#BYHWT-treated 50 g·kg－1·d－125.9 ±1.5# 7.5 ±1.0#Sham-operation 8 ml·kg－1·d －123.4 ±1.1 8.0 ±1.0

2.2補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)VD大鼠海馬組織CREB DNA結(jié)合活性的影響經(jīng)EMSA檢測(cè)和對(duì)特異性寡核苷酸與核蛋白的結(jié)合條帶的密度掃描和分析發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬組織核提取物均有與預(yù)先設(shè)計(jì)的CREB DNA序列的結(jié)合:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織CREB的DNA結(jié)合活性明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，尼莫地平組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠海馬組織CREB結(jié)合活性明顯升高(P＜0.01);尼莫地平組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠海馬組織CREB的結(jié)合活性之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，見(jiàn)Fig 1。

2.3補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)VD大鼠海馬組織C/EBP DNA結(jié)合活性的影響經(jīng)EMSA檢測(cè)和對(duì)特異性寡核苷酸與核蛋白的結(jié)合條帶的密度掃描和分析發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬組織核提取物均有與預(yù)先設(shè)計(jì)的C/EBP DNA序列的結(jié)合:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織C/EBP的DNA結(jié)合活性明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，尼莫地平組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠海馬組織C/EBP結(jié)合活性明顯升高(P＜0.01);尼莫地平組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠海馬組織CREB的結(jié)合活性之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 1 Comparision of CREB DNA-binding activity in rat's hippocampus among four groups(±s，n=8)

3 討論

VD為一慢性進(jìn)行性疾病，反復(fù)缺血/再灌注和長(zhǎng)期慢性低灌流是發(fā)病機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)制備模型所采用的改良的Pulsinelli's四血管阻斷法(4-VO)，能較好得模擬人類因動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病所致的VD而無(wú)明顯的肢體活動(dòng)障礙，是國(guó)際公認(rèn)的制備血管性癡呆模型的方法之一［5］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯方重用生黃芪，大補(bǔ)脾胃之元?dú)?，令氣旺血行，瘀去絡(luò)通;當(dāng)歸尾長(zhǎng)于活血，有化瘀而不傷好血之妙;川芎、赤芍、桃仁、紅花助當(dāng)歸尾活血祛瘀，地龍可通經(jīng)活絡(luò)。有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有降低興奮性氨基酸毒性、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷的恢復(fù)、抑制自由基的產(chǎn)生及抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載等對(duì)抗腦缺血/再灌注損傷作用［6］。本研究應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯提高，其作用機(jī)制有待深入研究。

Fig 2 Comparision of C/EBP DNA-binding activity in rat's hippocampus among four groups(±s，n=8)

長(zhǎng)期記憶形成不但需要新蛋白質(zhì)的合成，而且需要新基因的轉(zhuǎn)錄。Han等［7］確定影響記憶存儲(chǔ)的關(guān)鍵蛋白為CREB，可調(diào)節(jié)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation，LTP)和突觸可塑性相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)，海馬CREB的DNA結(jié)合活性與VD大鼠認(rèn)知功能下降的程度呈正相關(guān)，表明CREB可能在VD大鼠學(xué)習(xí)記憶損害中發(fā)揮了作用。VD大鼠經(jīng)補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后CREB的DNA結(jié)合活性及學(xué)習(xí)和記憶能力明顯增強(qiáng)，其機(jī)制可能為補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)提高CREB的活性，在缺血性損傷后提供神經(jīng)保護(hù)信號(hào)［8］。CREB對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、再生和修復(fù)起重要作用，如CREB磷酸化后不僅可調(diào)節(jié)即早基因如c-fos、c-jun等的表達(dá)，而且還調(diào)節(jié)抗凋亡和保護(hù)性蛋白分子(Bcl-2、降鈣素基因相關(guān)肽等)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等)的表達(dá)［9－10］，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血性癡呆可塑性和學(xué)習(xí)記憶的保護(hù)。

C/EBP是CREB靶基因的產(chǎn)物，可進(jìn)一步的激活晚期效應(yīng)基因的表達(dá)，編碼長(zhǎng)期調(diào)節(jié)突觸功能所必須的蛋白質(zhì)，是記憶形成后的鞏固過(guò)程的重要因素［3］。在長(zhǎng)時(shí)程記憶過(guò)程中，Ca2+和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)了海馬神經(jīng)元C/EBP的表達(dá)和DNA結(jié)合活性［11］。本研究發(fā)現(xiàn)VD大鼠海馬CREB及C/EBP結(jié)合活性的下降呈一致性，提示CREB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的抑制參與了血管性癡呆的形成。補(bǔ)陽(yáng)還五湯改善VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的障礙可能是通過(guò)增強(qiáng)CREB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。

在短暫大腦缺血/再灌注的早期，C/EBPβ促進(jìn)了大腦的免疫損傷反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡［12］，其機(jī)制與誘導(dǎo)早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1(Egr-1)及其下游基因纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白介素-1(IL-1)等有關(guān)［12－13］。最近研究發(fā)現(xiàn) C/EBP 同源蛋白(CHOP)還參與了缺血后海馬神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性的細(xì)胞凋亡［14］。但是對(duì)于慢性腦缺血過(guò)程中C/EBP的作用研究比較少。本研究發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注損傷30 d后，模型組大鼠的C/EBP活性相對(duì)于假手術(shù)組下降，補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后C/EBP活性較模型組升高，機(jī)制可能為CREB活性的增強(qiáng)促進(jìn)了C/EBP的表達(dá)，從而加強(qiáng)了后者的活性。對(duì)于腦缺血/再灌注后期C/EBP介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄其效應(yīng)分子為何以及它們?cè)谘苄园V呆中發(fā)揮怎樣的作用還需進(jìn)一步探討。有人認(rèn)為，腦卒中后早期的基因調(diào)節(jié)參與了神經(jīng)細(xì)胞的存活和死亡，后期調(diào)節(jié)的基因可能與組織修復(fù)和功能恢復(fù)有關(guān)［12］。

［1］陳磐華，吳永杰，秦俊法.加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療血管性癡呆臨床研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(7):25 －6.

［1］Chen P H，Wu Y J，Qin J F.Clinical study of modified Buyanghuanwu Decoction in the treatment of vascular dementia［J］.Chin J Inform Tradit Chin Med，2007，14(7):25 －6.

［2］Leutgeb J K，F(xiàn)rey J U，Behnisch T.Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures［J］.Neuroscience，2005，131(3):601 －10.

［3］Osada S，Yamamoto H，Nishihara T，Imagawa M.DNA binding specicity of the CCAAT/enhancer-binding protein transcription factor family［J］.Biol Chem，1996，271(12):3891 －6.

［4］Schmidt-Kastner R，Paschen W，Ophoff B G，Hossmann K A.A modified four-vessel occlusion model for inducing in complete forebrain ischemia in rats［J］.Stroke，1989，20(7):938 －46.

［5］趙 勇，崔淑芳，湯 球.血管性癡呆動(dòng)物模型研究進(jìn)展［J］.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2005，25(1):54 －8.

［5］Zhao Y，Cui S F，Tang Q.Recent research progress in animal models of vascular dementia［J］.Shanghai Lab Animal Sci，2005，25(1):54－8.

［6］徐 晶，辛隨成，張青川.補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦血管病的研究進(jìn)展［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，10(4):73 －6.

［6］Xu J，Xin S C，Zhang Q C.The research progression of buyanghuanwutang on ischemic cerebrovascular disease［J］.J Shanxi Coll Tradit Chin Med，2009，10(4):73 －6.

［7］Han J H，Kushner S A，Yiu A P，et al.Neuronal competition and selection during memory formation［J］.Science，2007，316(5823):457－60.

［8］光紅梅，杜冠華.cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白與神經(jīng)退行性疾?。跩］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(3):262－6.

［8］Guang H M，Du G H.Involvement of cAMP response element binding protein in neurodegenerative disorders［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(3):262 －6.

［9］李文聯(lián)，王 玲，張紅愛(ài).Ca2+對(duì)新生大鼠腦缺氧缺血后CREB磷酸化及神經(jīng)元凋亡的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(3):217 －9.

［9］Li W L，Wang L，Zhang H A.Influence of Ca2+on the phosphorylation of CREB，and the relationship between pCREB and apoptotic neurons in neonatal rats after hypoxic-ischemia［J］.J Fourth Mil Med Univ，2004，25(3):217 －9.

［10］任廣立，孫海宏，汪 洋，等.新生鼠缺氧缺血/再灌注后海馬p-CREB的表達(dá)［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(17):1578－80.

［10］Ren G L，Sun H H，Wang Y，et al.Expression of p-CREB in the hippocampal of neonatal rats after hypoxic-ischemia brain damage and reperusion［J］.J Fourth Mil Med Univ，2003，24(17):1578－80.

［11］Yukawa K，Tanaka T，Tsuji S，Akira S.Expressions of CCAAT/enhancer-binding proteins beta and delta and their activities are intensified by cAMP signaling as well as Ca2+/calmodulin kinases activation in hippocampal neurons［J］.Biol Chem，1998，273(47):31345－51.

［12］Kapadia R，Tureyen K，Bowen K K.Decreased brain damage and curtailed inflammation in transcription factor CCAAT/enhancer binding protein beta knockout mice following transient focal cerebral ischemia［J］.Neurochem，2006，98(6):1718 －31.

［13］Lu A，Tang Y，Ran R，et al.Genomics of the periinfarction cortex after focal cerebral ischemia［J］.Cereb Blood Flow Metab，2003，23(7):786－810.

［14］Osada N，Kosuge Y，Ishige K，et al.Characterization of neuronal and astroglial responses to ER stress in the hippocampal CA1 area in mice following transient forebrain ischemia［J］.Neurochem Int，2010，57(1):1 －7.