梁 惠，劉 穎，韓 磊，賀 娟，張文卿，馬愛國

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)研究所，山東 青島 266021;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071;3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，山東青島 266003;4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

肝癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的頑癥之一。近年來，海洋萜類化合物的天然抗氧化、抗腫瘤活性已引起人們的廣泛關(guān)注［1］。凹頂藻是海洋萜類化合物的重要來源，課題組前期已從三列凹頂藻中成功獲得總萜含量為63.3%的凹頂藻萜提取物，并進(jìn)行一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，獲得了可喜的研究結(jié)果［2－4］。但目前關(guān)于凹頂藻萜類化合物對 H22腫瘤p53和MMP-9表達(dá)及氧化應(yīng)激水平的影響，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以凹頂藻萜提取物為干預(yù)物，觀察其對小鼠H22腫瘤的抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及瘤株清潔級昆明小鼠，18～23 g，♂，由青島市實(shí)驗(yàn)動物中心提供。H22小鼠肝癌細(xì)胞株，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所引進(jìn)。

1.2主要試劑凹頂藻萜提取物(LTE)，為本實(shí)驗(yàn)室所有;兔抗小鼠突變型p53抗體、MMP-9抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司);免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);SOD及MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);

1.3動物模型的建立40只昆明小鼠隨機(jī)分為模型組、LTE低、中、高劑量干預(yù)組。于小鼠左前肢腋窩皮下接種2×109·L－1的H22肝癌細(xì)胞懸液0.2 ml。24 h后，模型組給予大豆色拉油0.5 ml·d－1灌胃;LTE低、中、高劑量干預(yù)組給予大豆色拉油稀釋的 LTE 溶液 25、50、100 mg·kg－1·d－10.5 ml灌胃;各組均連續(xù)給藥2周，觀察小鼠生長情況。

1.4樣品采集末次給藥24 h后，小鼠腹主動脈取血，肝素抗凝，用于抗氧化指標(biāo)檢測。完整剝離腫瘤，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率/%=(對照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.5LTE對小鼠H22腫瘤組織中突變型p53和MMP-9表達(dá)的影響取上述各組小鼠新鮮腫瘤組織常規(guī)做石蠟切片，按照SP免疫組化試劑盒說明書操作。

1.6LTE對H22小鼠血漿過氧化指標(biāo)的影響按照試劑盒說明書操作。

1.7LTE對紅細(xì)胞溶血度的影響采用比色法檢測。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)小鼠成瘤情況模型組小鼠腫瘤生長潛伏期(TT)短，2 d即可成瘤，且生長迅速。與模型組比較，LTE各劑量組小鼠TT達(dá)到3～4 d，腫瘤生長緩慢。各組小鼠成瘤率為100%。

2.2LTE對H22小鼠腫瘤質(zhì)量的影響模型組小鼠腫瘤質(zhì)量較大，達(dá)到(2.68±0.86)g;LTE各組小鼠H22腫瘤生長均明顯受到抑制，分別達(dá)到(1.94±0.52)、(1.74±0.65)和(1.56±0.44)g，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。且隨著藥物劑量的增加，抑瘤率逐漸升高，分別達(dá)到27.5%、34.9%和41.4%，具有量效依賴趨勢。

2.3LTE對小鼠H22腫瘤組織中突變型p53和MMP-9表達(dá)的影響LTE高劑量組突變型p53和MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)率下降，與模型組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Effect of LTE on expression of p53 and MMP9 in H22 mice(±s)

Tab 1 Effect of LTE on expression of p53 and MMP9 in H22 mice(±s)

*P＜0.05 vs model group

Group n Dose/mg·kg－1·d －1 Positive rate/%p53 MMP-9 Model 9 0.00 42.5 ±1.31 75.1 ±2.68 LTE 9 25.00 35.6 ±1.69 65.9 ±1.52 8 50.00 30.1 ±1.74 42.6 ±1.36*7 100.00 20.8 ±0.64* 32.5 ±0.83*

2.4LTE對H22小鼠血漿過氧化指標(biāo)的影響LTE高劑量組SOD酶活力明顯升高，而中、高劑量組MDA含量則減少，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。見Tab 2。

2.5LTE對H22小鼠紅細(xì)胞溶血度的影響中、高劑量組紅細(xì)胞溶血度明顯下降，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Effect of LTE on hemolytic degree and SOD and MDA in serum of H22 mice(±s)

Tab 2 Effect of LTE on hemolytic degree and SOD and MDA in serum of H22 mice(±s)

*P＜0.05 vs model group

Group n Dose/mg·kg－1·d－1 hemolytic degree/%Model 9 0.00 28.87 ±3.17 57.98 ±4.16 14.52 ±5.67 SOD/kU·L－1 MDA/μmol·L －1 LTE 9 25.00 35.01 ±5.84 45.22 ±8.81 11.42 ±6.63 8 50.00 42.95 ±7.23 32.39 ±6.16* 7.57 ±3.34*7 100.00 57.13 ±6.38* 24.85 ±3.68* 6.40 ±2.16*

3 討論

突變型p53蛋白是腫瘤組織所特有的標(biāo)志蛋白，檢測該基因蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)情況是反映腫瘤生長狀況的一個重要指標(biāo)［5］。MMP-9又稱明膠酶B(gelatinase-B)，檢測腫瘤組織中MMP-9蛋白的表達(dá)情況對評價(jià)藥物對腫瘤的治療效果具有重要意義［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LTE干預(yù)組腫瘤生長普遍被抑制，同時(shí)，其p53和MMP-9蛋白的表達(dá)水平明顯下降。表明LTE可通過下調(diào)p53和MMP-9等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，限制腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，抑制小鼠H22腫瘤組織生長。

大量研究證實(shí)，腫瘤患者可通過多種途徑引發(fā)氧化應(yīng)激，而提高SOD、GSH等抗氧化劑的表達(dá)水平及活性，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。H2O2是活性氧的一種，通常被用于誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血，以檢測紅細(xì)胞膜抗氧化能力［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一定劑量的LTE可明顯提高H22荷瘤小鼠血漿中SOD酶活力，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，減少H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血。表明LTE具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可有效阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力，這可能也是LTE抑制H22腫瘤生長的另一機(jī)制。

總之，凹頂藻萜類化合物作為一種海洋天然活性物質(zhì)，可有效抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長，值得進(jìn)一步開發(fā)利用和深入探索。

［1］Cheung F W，Li C，Che CT，et al.Geoditin A induces oxidative stress and apoptosis on human colon HT29 cells［J］.Mar Drugs，2010，8(1):80 －90.

［2］董春景，梁 惠，賀 娟，馬愛國.海藻萜類化合物對二甲基苯蒽誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌的抑制作用［J］.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2007，29(2):197－8.

［2］Dong C J，Liang H，He J，Ma A G.The Antitumor effects of laurencia terpenoids extract on breast carcinoma induced by DMBA in rats［J］.Acta Nutr Sin，2007，29(2):197 －8.

［3］劉 穎，梁 惠，蘇 愛，等.海兔素對人胃癌細(xì)胞 SGC-7901增殖和凋亡的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(3):333－7.

［3］Liu Y，Liang H，Su A，et al.Effect of aplysin on the proliferation and apoptosis in human gastric cancer cell SGC-7901［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):333 －7.

［4］劉 穎，梁 惠，徐宏偉，等.海兔素對S180荷瘤小鼠的抑瘤活性及其免疫作用的實(shí)驗(yàn)觀察［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(11):1403－5.

［4］Liu Y，Liang H，Xu H W，et al.Anticancer activities and imm unologic function of Aplysin［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(11):1403－5.

［5］Acun T，Terzioglu-Kara E，Konu O，et al.Mdm2 Snp309 G allele displays high frequency and inverse correlation with somatic p53 mutations in hepatocellular carcinoma［J］.Mutat Res，2010，684(1－2):106－8.

［6］Ahmad A，Kong D，Wang Z，et al.Down-regulation of uPA and uPAR by 3，3'-diindolylmethane contributes to the inhibition of cell growth and migration of breast cancer cells［J］.J Cell Biochem，2009，108(4):916 －25.

［7］Acharya A，Das I，Chandhok D，Saha T.Redox regulation in cancer:a double-edged sword with therapeutic potential［J］.Oxid Med Cell Longev，2010，3(1):23－34.