田 濤，馬 賓，王明霞，蔡 鑫，劉進軍，方 羚，吳士禮，高 琴，于 影，關旭東

(蚌埠醫(yī)學院1.第一附屬醫(yī)院心血管科、2.第一附屬醫(yī)院門診部，安徽蚌埠 233004;3.蚌埠醫(yī)學院生理學教研室，安徽 蚌埠233030)

急性心肌梗死嚴重威脅人類健康，及早的再灌注治療，是挽救患者生命，改善預后的關鍵。但缺血心肌在恢復血供后可出現(xiàn)一系列再灌注損傷，使損傷反而加重。因此，探索如何減輕缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是心血管領域研究的熱點。雖然缺血預處理和藥物預處理能夠有效減輕I/R損傷，但由于在臨床工作中心肌缺血難以預測，所以其應用受到一定限制。繼Zhao等［1］首次提出缺血后處理概念后，Staat等［2］首次將其應用于臨床，效果肯定。然而，缺血后處理雖可減輕I/R損傷，但由于存在倫理及操作的制約，從而限制了其應用［3］。為此，運用藥物模擬缺血后處理心肌保護機制，減輕I/R損傷，可作為一種安全有效的方法。吡那地而作為一種ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channels，KATP)開放劑可減輕 PC12細胞(神經(jīng)細胞的替代模型)缺血缺氧損傷［4］及離體心肌I/R損傷。但其對在體心肌I/R損傷的影響尚未見報道。本文研究旨在利用家兔在體心肌I/R損傷模型，觀察吡那地爾后處理是否具有減輕心肌I/R損傷的作用，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組采用左冠狀動脈前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)結扎30 min、復灌120 min的方法建立心肌I/R模型。選擇健康成年♂家兔40只(蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心提供)，每只體重2.5～3.0 kg，隨機分為5組(每組8只)，分別為①假手術組(Sham):開胸后，絲線從LAD下方穿過但不結扎;②缺血/再灌組(I/R):結扎LAD 30 min后，復灌120 min;③缺血后處理組(I-PostC):結扎LAD 30 min后，于復灌即刻，給予3輪復灌15 s/缺血15 s作為后處理;④吡那地爾后處理組(Pina):復灌即刻，通過左心室(left ventricle，LV)導管給予吡那地爾0.1 mg·kg－1，余同I/R組;⑤吡那地爾后處理+5-羥葵酸組(Pina+5-HD):復灌即刻，通過左心室導管給予吡那地爾0.1 mg·kg－1及 5-HD 5 mg·kg－1，余同 I/R 組。

1.2藥物及試劑吡那地爾(pinacidil)，5-羥葵酸(5-hydroxy decanoate，5-HD)購自 Sigma公司;伊文斯藍(Evan’s Blue)，2，3，5，-氯化三苯基四氮唑(2，3，5 triphenyl-tetrazolium chloride，TTC)購自 BIOSHARP公司;磷酸肌酸激酶(creatine kinase，CK)，丙二醛(malonaldchyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;逆轉錄及PCR試劑盒購自天根生化科技公司;Bcl-2、Bax及β-actin引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3動物模型的制備參照文獻建立模型［5］。經(jīng)耳緣靜脈注射烏拉坦1.2g·kg－1麻醉動物。四肢及胸前皮下置入電極，監(jiān)測心電圖變化。氣管切開，連接呼吸機，呼吸頻率設定為40～50次/min，潮氣量為10 ml·kg－1，呼吸比為1.5∶1。右頸總動脈插入與動脈大小相吻合的導管，進入左心室，導管末端通過壓力換能器連接Medlab生物信號采集系統(tǒng)。于胸骨左緣處做一切口。逐層分離肌層見第4肋骨，剪斷后進胸。切開心包暴露心臟，在LAD根部穿雙股4-0號絲線，結扎其中一股造成心肌梗死(結扎時用一細膠管墊于LAD與結扎線之間)，復灌時剪斷此線;另一股絲線兩端套一自制的細塑料管，在行缺血后處理時拉緊絲線造成缺血，放松則恢復灌注。建模成功標準:結扎絲線后，心電圖胸導聯(lián)ST段出現(xiàn)弓背向上抬高、T波高聳等表現(xiàn)，為缺血成功;剪斷絲線后，抬高的ST段下降，為復灌成功。

1.4觀察指標

1.4.1血流動力學指標的觀察手術完成后，令家兔心臟穩(wěn)定30 min后，再結扎LAD。用Medlab生物信號采集系統(tǒng)分別記錄缺血前、缺血30 min和復灌120 min時左心室收縮壓(left ventricular systolic ressure，LVSP)和左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)。

1.4.2血漿CK和MDA活性的測定各組于缺血前、缺血30 min和復灌120 min時，由股靜脈取血2 ml，3 000 r·min－1離心 15 min，收集上清，用 721 型分光光度計在660 nm處測定CK活性，在532 nm處測定血漿MDA含量。

1.4.3心肌缺血及梗死面積測定參照文獻［6］，于復灌結束后，原位結扎LAD，取出心臟，用生理鹽水漂洗心腔內(nèi)積血，由升主動脈注入0.01 mol·L－1的Evan’s Blue1.2 ～1.4 ml，凍存30 min 后，沿垂直于心臟長軸的方向，自心尖到結扎部位，將其切成6～8片1.5 mm厚的薄片，然后置于0.03 mol·L－1的TTC中避光37℃水浴 15 min，再經(jīng)3.33 mol·L－1甲醛固定10 min后，可見梗死區(qū)(infarct size，IS)心肌呈灰白色;危險區(qū)(area at risk，AAR)呈紅色;未缺血區(qū)呈藍色。數(shù)碼相機拍照并用Image J圖像分析軟件分析缺血面積(AAR占LV的比值)及梗死面積(IS占AAR的比值)。

1.4.4心肌Bcl-2、Bax mRNA表達的測定運用逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-RCR)檢測心肌細胞Bcl-2和Bax mRNA的表達。應用Primer Premier軟件設計引物。Bcl-2引物序列:上游5'-GCGAGAAGAGCG AGAACAACT-3'，下游 5'-CCTCCAAACAGCAGGATG AAC-3'，產(chǎn)物為454 bp。Bax引物序列:上游5'-G AGAAGGCTGAGAATGGAGATAAG-3'，下游 5'-TGA TGGAAGGGAGTGAAGAATAAC-3'，產(chǎn)物為 351 bp。β-actin引物序列:上游 5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下 游 5'-CTGCAAGGTGGACAGCGAGG-3'，產(chǎn)物為205 bp。復灌結束后，取100 mg LV前壁心肌組織，迅速置于－80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。用TRIzol提取心肌組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。在Taq DNA聚合酶作用下進行PCR擴增，94℃預變性8 min，94℃變性1 min，退火(Bcl-2:53℃，Bax:52℃，β-actin:59℃)1 min，72℃ 延伸 50 s，共 32 個循環(huán)，72℃充分延伸10 min后，4℃終止反應。每個標本取5 μl產(chǎn)物在15 g·L－1瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠顯色。用凝膠圖像處理系統(tǒng)拍攝記錄，并使用圖像分析軟件對凝膠中每一泳帶進行光密度掃描作半定量分析，以目的基因與內(nèi)參對照的積分吸光度比值(Bcl-2/β-actin;Bax/β-actin)表示 mRNA 相對表達量。

1.5統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較應用q檢驗。

2 結果

2.1心功能參數(shù)復灌120 min時，與I/R組比較，I-PostC組和Pina組動物LVSP升高，LVEDP降低(P＜0.05);與Pina+5-HD組比較，I-PostC組和Pina組動物 LVSP升高，LVEDP降低(P＜0.05)。比較I-PostC組與Pina組LVSP及LVEDP，未見差異(P＞0.05);比較I/R組與Pina+5-HD組LVSP及LVEDP，未見差異(P＞0.05)，詳見 Tab 1。

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=8)

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R;△P＜0.05 vs Pina+5-HD

Variable Group Basline Ischemia 30 min Reperfusion 120 min LVSP/kPa Sham 16.08 ±0.97 15.97 ±0.64 15.58 ±1.72 I/R 15.55 ±0.85 11.13 ±0.57* 12.58 ±0.77 I-PostC 16.12 ±1.02 11.69 ±1.33* 14.50 ±0.86#△Pina 16.18 ±1.18 11.36 ±1.20* 13.95 ±1.16#△Pina+5-HD 16.28 ±0.99 11.34 ±0.69* 12.34 ±0.84 LVEDP/kPa Sham 1.06 ±0.29 1.08 ±0.24 1.24 ±0.27 I/R 1.14 ±0.17 2.17 ±0.46* 2.18 ±0.49 I-PostC 1.05 ±0.21 2.07 ±0.47* 1.73 ±0.40#△Pina 1.22 ±0.30 2.28 ±0.53* 1.72 ±0.46#△Pina+5-HD 1.16 ±0.33 2.26 ±0.48*2.20 ±0.50

2.2血漿CK活性復灌120 min時，I-PostC組和Pina組血漿CK活性較I/R組明顯降低(P＜0.05);與Pina+5-HD組相比，I-PostC組和Pina組血漿CK活性也明顯降低(P＜0.05)。比較I-PostC組與Pina組CK活性，未見差異(P＞0.05);比較I/R組與Pina+5-HD組CK活性，也未見差異(P＞0.05)，詳見Tab 2。

2.3血漿MDA含量在復灌120 min時，與I/R組相比，I-PostC組和Pina組血漿MDA含量明顯降低(P＜0.05);與Pina+5-HD組相比，I-PostC組和Pina組血漿MDA含量也明顯降低(P＜0.05)。比較I-PostC組與Pina組血漿MDA含量，未見差異(P＞0.05);比較I/R組與Pina+5-HD血漿MDA含量，也未見差異(P＞0.05)，詳見Tab 2。

2.4心肌梗死面積比較I/R組、I-PostC組、Pina組和 Pina+5-HD組 AAR/LV，未見差異(P＞0.05)。與I/R組相比，I-PostC組和Pina組IS/AAR明顯減少(P＜0.05);與 Pina+5-HD組比較，IPostC組和Pina組IS/AAR明顯減少(P＜0.05)。比較I-PostC組與 Pina組IS/AAR，未見差異(P＞0.05);比較I/R組與Pina+5-HD組IS/AAR，也未見差異(P＞0.05)，詳見Tab 3。

2.5心肌細胞Bcl-2、Bax基因的表達5組均分別擴增出454 bp的Bcl-2目的片段、351 bp的Bax目的片段和205 bp的β-actin目的片段，見 Fig 1。與I/R組比較，I-PostC組和Pina組Bcl-2 mRNA表達增加，Bax mRNA表達降低(P＜0.05);與Pina+5-HD組比較，I-PostC組和Pina組Bcl-2 mRNA表達增加，Bax mRNA表達降低(P＜0.05)。比較 IPostC組與Pina組Bcl-2 mRNA表達及Bax mRNA的表達，未見差異(P＞0.05);比較I/R組和Pina+5-HD組Bcl-2 mRNA表達及Bax mRNA的表達，也未見差異(P＞0.05)，詳見Fig 2。

Fig 1 Expressions of Bcl-2 and Bax mRNA of each group(RT-PCR)

Fig 2 Expressions of Bcl-2 and Bax mRNA of each group

Tab 2 Serum CK and MDA content of each group(±s，n=8)

Tab 2 Serum CK and MDA content of each group(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R;△P＜0.05 vs Pina+5-HD

Variable Group Baseline Ischemia 30 min Reper fusion 120min CK/U·L－1 Sham 832.43 ±155.01 838.04 ±158.78 828.46 ±116.40 I/R 878.51 ±129.72 1195.66 ±223.44* 3681.38 ±598.58 I-PostC 856.12 ±116.08 1171.03 ±219.40* 2428.66 ±290.60#△Pina 787.00 ±143.37 1116.80 ±238.93* 2423.71 ±414.31#△Pina+5-HD 824.34 ±132.10 1094.07 ±203.09* 3418.50 ±507.36 MDA/μmol·L －1 Sham 2.23 ±0.18 2.25 ±0.21 2.27 ±0.23 I/R 2.21 ±0.14 2.40 ±0.18 4.96 ±0.70 I-PostC 2.22 ±0.20 2.38 ±0.24 4.03 ±0.41#△Pina 2.14 ±0.19 2.42 ±0.21 3.82 ±0.34#△Pina+5-HD 2.13 ±0.16 2.30 ±0.24 5.05 ±0.78

Tab 3 AAR/LV and IS/AAR of each group(±s，n=4)

Tab 3 AAR/LV and IS/AAR of each group(±s，n=4)

*P＜0.05 vs I/R;#P＜0.05 vs Pina+5-HD

Group AAR/LV/% IS/AAR/%I/R 46.95 ±6.18 49.95 ±7.31 I-PostC 45.45 ±5.26 26.62 ±5.60*#Pina 48.13 ±7.90 24.98 ±4.39*#Pina+5-HD 49.66 ±7.09 48.18 ±5.38

3 討論

實驗結果顯示，缺血后處理及吡那地爾后處理均能夠明顯改善復灌后心肌的舒縮功能，降低心肌細胞CK的釋放，減輕心肌細胞的過氧化，減少心肌梗死的面積，上調(diào)心肌Bcl-2 mRNA表達，下調(diào)Bax mRNA表達。

目前已經(jīng)證實，缺血后處理可通過開放線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP)發(fā)揮減輕 I/R損傷作用［7］。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，選用KATP激活劑吡那地爾作為后處理，通過模擬缺血后處理機制，減輕心肌I/R損傷。且這一心肌保護作用可被mitoKATP抑制劑5-HD所阻斷。但吡那地爾后處理能否通過激活心肌細胞膜KATP，發(fā)揮減輕I/R的作用，尚需進一步證實。近期有研究報道［8］，缺血后處理心肌保護作用的發(fā)揮僅涉及mitoKATP的開放，不涉及心肌細胞膜KATP的開放。此外，吡那地爾后處理還可能通過激活血管平滑肌膜KATP，擴張外周及冠狀動脈，從而在復灌時發(fā)揮減輕心臟前負荷、改善心肌血供的作用［9］。

Bcl-2家族主要由Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等抗凋亡成員及 Bax、Bak、Bad等促凋亡成員組成。其中，Bcl-2和Bax是目前研究細胞凋亡的熱點基因，兩者比值反映了促凋亡和抗凋亡力量的對比［10］。Bax等促凋亡蛋白通過結合線粒體通透轉換孔復合體，啟動內(nèi)源性線粒體凋亡途徑［11］。有研究表明，I/R損傷可由促凋亡蛋白Puma通過與Bcl-2及Bcl-xL結合，釋放出 Bax和 Bak，導致細胞凋亡［12］。本實驗發(fā)現(xiàn)，與單純?nèi)毖?復灌相比，吡那地爾后處理可上調(diào)心肌Bcl-2 mRNA的表達，下調(diào)Bax mRNA的表達，發(fā)揮抗凋亡，減輕I/R損傷的作用。但mitoKATP的激活是否與Bcl-2及Bax mRNA的表達的變化存在具體關系，尚需進一步研究證實。有研究表明，線粒體乙醛脫氫酶2可影響B(tài)cl-2及Bax mRNA的表達，發(fā)揮抗I/R 損傷的作用［13］。

綜上所述，吡那地爾后處理具有減輕心肌I/R損傷的作用。其機制可能是通過模擬I-PostC，開放心肌細胞mitoKATP，上調(diào)心肌Bcl-2 mRNA表達的及下調(diào)Bax mRNA表達來實現(xiàn)。雖然兩種后處理方式心肌保護的效果相當，但吡那地爾后處理更安全，適用范圍更廣。

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