龔受基，劉仲華，黃建安，王麗麗，楊新河，4

(1.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，2.湖南農業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南長沙 410128;3.桂林醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，廣西桂林 541004;4.孝感學院生命科學技術學院，湖北孝感 432000)

胰島素抵抗是糖尿病發(fā)病機制之一，而肝臟胰島素抵抗是引起2型糖尿病的重要因素［1］?？偰懝檀?TC)和總甘油三酯(TG)在肝臟中的沉積會引起機體胰島素抵抗。HepG2細胞株較好的保留了肝細胞的多種生物學特性，具有和人類肝臟相似的代謝能力，能夠多代遺傳，并且能夠表達多種影響糖脂代謝相關酶的基因，是體外研究糖脂代謝、胰島素抵抗的經(jīng)典細胞模型［2］。

在正常情況下人體血清自由脂肪酸含量較低［3］，而高濃度自由脂肪酸可以導致肝臟脂肪沉積，從而引發(fā)胰島素抵抗，但目前對自由脂肪酸產生胰島素抵抗的機制研究并不深入，分子機制也不明確［4］。本實驗考察軟脂酸(palmitate)對 HepG2細胞糖脂代謝的影響，研究影響糖脂代謝相關基因的表達，探討自由脂肪酸產生胰島素抵抗的機制，期待能夠闡明某些產生胰島素抵抗的原因。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器HepG2細胞株購于上海生命科學研究院;PCR引物，生工生物工程(上海)有限公司合成;鹽酸二甲雙胍，壽光富康制藥有限公司產品;辛伐他丁，湖北絲寶藥業(yè)有限公司產品;多功能酶標儀 Varioskan Flash，Thermo Fisher Scientific產品;Rotor Gene-Q熒光定量PCR儀，Qiagen產品。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)HepG2細胞培養(yǎng)于5%CO2、37℃環(huán)境中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的低糖(5.55 mmol·L-1)DMEM。選取4～15代細胞，于70%～80%融合度時，經(jīng)0.25%胰酶消化后分散成5×108·L-1細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)板。

1.2.2TC/TG測定HepG2細胞以軟脂酸或藥物處理，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，收集細胞。將細胞凍融3次，超聲波輔助裂解，直至細胞懸液澄清［5］，按試劑盒操作測定吸光度，計算總膽固醇、甘油三酯含量，結果用每g總蛋白中的總膽固醇、甘油三酯量表示(mmol·g-1Pro)?？偟鞍缀坑肂CA方法測定。

1.2.3糖原含量測定按文獻方法測定糖原含量［6］。細胞內糖原含量(g·g-1Pro)=樣品光密度值/標準光密度值×標準品糖原含量(g·g-1Pro)。

1.2.4熒光PCR檢測基因表達經(jīng)軟脂酸誘導或藥物處理的 HepG2細胞，按試劑盒操作提取總RNA，并逆轉錄，熒光定量PCR擴增檢測目標基因表達，各組間相對基因表達用2-△△Ct表示。

1.3統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組內采用單因素分析，組間采用t檢驗分析。

2 結果

2.1軟脂酸對HepG2細胞脂質累積的影響不同濃度軟脂酸誘導HepG2細胞16 h后，低濃度軟脂酸引起TC和TG累積較低，但在軟脂酸濃度達到0.08 mmol·L-1時，TG 生成量升高，TC 則在 2.0 mmol·L-1濃度時，才出現(xiàn)升高。見Fig 1。

Fig 1 Level of cholesterol and triglyceride in palmitate-induced HepG2 cells for 16h in different concentrations

2.2軟脂酸影響HepG2細胞糖原與脂質累積與時間的關系用軟脂酸(0.4 mmol·L-1)分別誘導HepG2 細胞 8、16、24、32、40 h，在 24 h 內 TC 和 TG累積呈上升趨勢，并在24 h達到最大值，然后下降。在第16 h糖原累積達到最大，隨后呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。見Fig 2。

Fig 2 Level of glycogen and lipid in palmitate-induced HepG2 cells in different hours

2.3二甲雙胍(metformin)和辛伐他丁(simvastatin)對軟脂酸誘導HepG2細胞脂質代謝的影響二甲雙胍(2.0 mmol·L-1)和辛伐他丁(0.02 mmol·L-1)均能有效降低由軟脂酸(0.4 mmol·L-1)誘導引起的TC和TG升高，分別降低TC 22.19%和21.93%，降低TG 21.52%和17.72%。見Fig 3。

Fig 3 Effect of metformin and simvastatin on TC and TG in palmitate-induced HepG2 cells

2.4metformin和simvastatin對軟脂酸誘導HepG2細胞糖原累積的影響軟脂酸(0.4mmol·L-1)誘導細胞中糖原累積降低，二甲雙胍(2.0mmol·L-1)和辛伐他丁(0.02mmol·L-1)能夠抑制這種作用，提高糖原累積，恢復到接近正常水平。見Fig 4。

Fig 4 Effect of metformin and simvastatin on glycogen in palmitate-induced HepG2 cells

2.5metformin和simvastatin對軟脂酸誘導HepG2細胞糖脂代謝相關基因的影響高濃度軟脂酸(0.4mmol·L-1)能夠抑制 AMPKα-2表達，AMPK活性劑二甲雙胍能高效逆轉這種抑制作用，而辛伐他丁對軟脂酸抑制的AMPKα-2沒有逆轉作用。見Fig 5。

Fig 5 Effect of metformin and simvastatin on AMPKα-2 mRNA in palmitate-induced HepG2 cells

軟脂酸(0.4mmol·L-1)誘導會導致糖代謝相關基因異常，下調GLUT2、G6pase mRNA表達，上調PEPCK mRNA表達;二甲雙胍(2.0 mmol·L-1)和辛伐他丁(0.02 mmol·L-1)能夠逆轉這種作用，使其恢復到接近正常水平。辛伐他丁對GLUT2 mRNA的逆轉作用強烈，相對值達到正常值的4.45倍。見Fig 6。

Fig 6 Effect of metformin and simvastatin on glucose metabolism genes in palmitate-induced HepG2 cells

軟脂酸(0.4mmol·L-1)誘導會引起脂質代謝相關基因的異常，下調HL、SREBP1 mRNA表達，上調ACC2 mRNA表達，二甲雙胍(2.0mmol·L-1)和辛伐他丁(0.02 mmol·L-1)能夠高效逆轉 HL、ACC2 mRNA表達，但對ACC2、SREBP1 mRNA異常沒有逆轉作用。見Fig 7。

3 討論

AMPK是真核生物中的信號傳感器，能反映生物體內的能量平衡與代謝平衡。軟脂酸能夠促進HepG2細胞中的脂質堆積，與其抑制AMPKα-2的表達有關系，還可能與抑制AMPK(Thr172)磷酸化有關。AMPK活化劑二甲雙胍能逆轉這種抑制作用，促進下游基因的調整，降低脂肪堆積，增加糖原累積。見Fig 8。

Fig 7 Effect of metformin and simvastatin on lipid metabolism genes in palmitate-induced HepG2 cells

Fig 8 Relation between glucose and lipid metabolism and energy

GLUT2是肝細胞表面的主要葡萄糖轉運子，介導胞外的葡萄糖入胞，軟脂酸抑制HepG2細胞中GLUT2 mRNA表達，降低GLUT2轉運葡萄糖通過細胞膜，下調肝細胞的糖代謝功能［7］。二甲雙胍能夠改善GLUT2 mRNA低表達，使其表達上調，辛伐他丁則大幅度上調GLUT2 mRNA的表達。

PEPCK介導糖異生，是糖異生的一個關鍵酶，其表達升高會導致肝糖原異生，使肝糖輸出增加［8］，肝糖原累積會減少。軟脂酸升高PEPCK mRNA表達，促進肝糖輸出，升高血糖，誘發(fā)胰島素抵抗。二甲雙胍和辛伐他丁都能夠降低PEPCK mRNA表達，抑制肝糖原異生，有利于改善血糖水平。

軟脂酸通過抑制 AMPKα-2 mRNA表達，調整HL mRNA的表達以抑制HepG2細胞內肝脂肪酶HL活性，減少對脂肪的分解作用，有利于脂肪在HepG2細胞內的堆積。二甲雙胍通過AMPKα-2上調HL mRNA表達，促進脂肪分解。辛伐他丁為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)抑制劑，能夠抑制HMGR表達，阻斷TC的合成，同時也上調HL mRNA表達，促進脂肪分解，從而調節(jié)糖脂代謝。

SREBP1主要作用是激活參與脂肪酸與甘油三酯代謝酶乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)和脂肪酸合成酶(FAS)基因表達。高濃度軟脂酸抑制SREBP1 mRNA表達，從而下調下游基因表達，降低脂肪的分解，增加脂肪在HepG2細胞中的堆積。本實驗中二甲雙胍和辛伐他丁都沒能逆轉軟脂酸對SREBP1的抑制作用，說明二甲雙胍和辛伐他丁改善HepG2細胞內脂肪堆積可能不是通過SREBP1起作用。

AMPK是ACC2的上游調整激酶，不但可以下調ACC2表達，還可以磷酸化219位絲氨酸(Ser219)，降低ACC2活性，阻止肉堿脂酰轉移酶(CPT-1)的抑制劑產生，加速長鏈脂肪酸酸轉移至線粒體內膜，增加脂肪酸的氧化［9］。AMPK活性劑二甲雙胍活化AMPK，從而減少ACC2 mRNA表達，使ACC2 mRNA表達恢復至接近正常水平。辛伐他丁也能夠降低ACC2 mRNA的表達，推測脂肪在HepG2細胞中的堆積減少至少部分通過介導減少ACC2 mRNA表達有關。

二甲雙胍和辛伐他丁能夠改善軟脂酸所致HepG2細胞糖原累積減少，主要通過降低PEPCK mRNA表達，抑制糖異生，同時上調GLUT2 mRNA表達，增加HepG2細胞表面葡萄糖轉運，為糖原累積提供原料。二甲雙胍和辛伐他丁都能夠降低軟脂酸所致HepG2細胞TC和TG含量增加。二甲雙胍主要通過活化 AMPK，上調 HL mRNA表達，減少ACC2 mRNA表達，促進脂肪分解來減少脂肪堆積。

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